تسريب التجسيمي من بلازميدة قليلة القسيمات اميلويد بيتا في الحصين ماوس
Summary
Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.
Abstract
مرض الزهايمر هو مرض الاعصاب التي تؤثر على شيخوخة السكان. وهناك ميزة عصبية مرضية الرئيسية لهذا المرض هو الإفراط في إنتاج اميلويد بيتا وترسب لويحات أميلويد بيتا في مناطق الدماغ للأفراد المصابين. على مر السنين العلماء قد ولدت العديد من نماذج الماوس مرض الزهايمر التي تحاول تكرار أمراض اميلويد بيتا. وللأسف، فإن نماذج الماوس فقط بشكل انتقائي تحاكي ملامح المرض. موت الخلايا العصبية، ولها تأثير بارز في أدمغة مرضى الزهايمر، تفتقر بشكل ملحوظ في هذه الفئران. وبالتالي، نحن وغيرنا قد استخدمت وسيلة لغرس مباشرة الأنواع القابلة للذوبان بلازميدة قليلة القسيمات من اميلويد بيتا – أشكال اميلويد بيتا التي ثبت أن يكون أكثر سمية للخلايا العصبية – stereotaxically في الدماغ. في هذا التقرير ونحن الاستفادة من الذكور C57BL / 6J الفئران لتوثيق هذه التقنية الجراحية لزيادة مستويات اميلويد بيتا في منطقة الدماغ محددة. الالهدف هو ضخ التلفيف المسنن من الحصين لهذا بنية الدماغ، جنبا إلى جنب مع الدماغ الأمامي القاعدية التي يتم توصيلها عن طريق الدائرة كوليني، يمثل واحدا من مجالات انحطاط في هذا المرض. نتائج رفع اميلويد بيتا في التلفيف المسنن عبر ضخ التجسيمي تكشف عن زيادة في فقدان الخلايا العصبية في التلفيف المسنن في حدود 1 في الاسبوع، في حين أن يصاحب ذلك زيادة في موت الخلايا وفقدان الخلايا العصبية كوليني في الطرف الرأسي للالفرقة قطري من بروكا من الدماغ الأمامي القاعدية. ولوحظت هذه التأثيرات لتصل إلى 2 أسابيع. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن اميلويد بيتا نموذج ضخ الحالي يوفر نموذج الفأر بديلة لمعالجة موت الخلايا العصبية منطقة محددة في فترة قصيرة. وميزة هذا النموذج هو أن اميلويد بيتا يمكن أن تكون مرتفعة بطريقة المكانية والزمانية.
Introduction
الودائع ترسبات الأميلويد، التي تتكون من بيتا اميلويد (Aβ 1-42)، هي سمة رئيسية من أمراض الزهايمر (AD). وقد أظهرت العديد من الدراسات أن مستويات عالية أو سامة المؤتلف بلازميدة قليلة القسيمات Aβ 1-42 حصول وفاة الخلايا العصبية، ضمور متشابك، وفقدان وخلل وظيفي. فضلا عن التعلم والذاكرة العجز 1-4. وتشمل مناطق الدماغ أثرت على الحصين، القشرة، وهياكل تحت القشرية مثل الدماغ الأمامي القاعدية و5،6 اللوزة. حتى الآن، وهناك عدة نماذج الماوس المعدلة وراثيا التي تحاول محاكاة Aβ 1-42 أمراض AD. اعتمادا على سلالة هذه الحيوانات تثبت أن تكون مفيدة في دراسة الخصائص المرضية مختارة من AD. للأسف، مع استثناء من 2 خطوط المعدلة وراثيا، APP23 و5XFAD، هذه الفئران أبدا تكرار بالكامل فقدان الخلايا العصبية، جانبا رئيسيا من جوانب AD. حتى مع فقدان الخلايا العصبية التي لوحظت في APP23 و5XFAD، وobser موت الخلايا العصبيةكان فيد خفية، سن المعالين، ومعزولة لقلة مختارة المناطق 7،8.
ضخ مباشر للبلازميدة قليلة القسيمات Aβ 1-42 في البرية من نوع مخ الفأر يوفر ممتازة في نموذج الجسم الحي الذي يعيد الجانب موت الخلايا العصبية من amyloidopathy 1،9،10. خلافا للنماذج الماوس المعدلة وراثيا المستخدمة عادة في بلازميدة قليلة القسيمات Aβ 1-42 نموذج ضخ مثالية لرفع مستويات حادة Aβ 1-42 بطريقة المكانية والزمانية. وميزة استخدام البرية من نوع الفئران لهذا النموذج يغني التعويض أو الآثار الجانبية المحتملة من الطفرات التي أدخلت في خطوط الماوس المعدلة وراثيا. وقد أظهرت دراسات سابقة أن غرس مستويات سامة من Aβ 1-42 في الحصين يتسبب موت الخلايا العصبية في المناطق القريبة من موقع الحقن ضمن 1 أسبوع 1. وعلاوة على ذلك، بما يتفق مع ملاحظة أن Aβ 1-42 سامة للخلايا العصبية الكوليني 11 الدماغ الأمامي القاعديةوانخفض الكوليني الخلايا العصبية (BFCN) السكان المشاريع التي لالحصين 20-50٪ في غضون 7-14 أيام التالية بيتا اميلويد ضخ 1،10 في الفئران، مما يسمح فعال للامتحانات من الدوائر العصبية معزولة في الدماغ. منذ مشروع BFCN ipsilaterally إلى التلفيف المسنن من الحصين 12، لمعظم تحكم جزء / مركبة وبلازميدة قليلة القسيمات Aβ 1-42 الحلول التي يمكن أن تحقن على جانبي الدماغ مما يتيح إجراء مقارنات بين اليسار واليمين نصفي الكرة الأرضية 1.
في هذا التقرير سوف نقدم منهجية مفصلة الجراحية وحقن للبالغين من النوع البري C57BL / 6J الفئران. تم اختيار هذه السلالة الماوس بسبب استخدامها على نطاق واسع في مجال البحوث. من الناحية الفنية، يمكن استهداف أي منطقة في الدماغ للتسريب، ولكن هنا سوف نستخدم التلفيف المسنن من الحصين كهدف لتوضيح هذه التقنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتحقيق النجاح Aβ 1-42 حقن المجرب أو الجراح أن: 1) استخدام تقنية العقيم؛ 2) تحديد منطقة في الدماغ بشكل صحيح في المصالح مع إحداثيات دقيقة. 3) أن يكون قادرا على تأمين الماوس بشكل صحيح في إطار التجسيمي مع الدماغ وتعادل في محور AP وML؛ 4) لديها القدرة على تشغيل micromanipulator بدقة. 5…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية منح NS081333 (لCMT)، الزهايمر منحة جمعية NIRG-10-171721 والمعهد الوطني للصحة النفسية منحة MH096702 (لUH)، والمعهد الوطني لبحوث الشيخوخة الممولة من مرض الزهايمر مركز جامعة كولومبيا AG008702 منح الطيار (لYYJ وJB).
Materials
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5×1.5mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 Gauge Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25×7.25in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
Riferimenti
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).
- Knowles, J. K., et al. The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).
- Troy, C. M., et al. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation. Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).
- Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. APP transgenic modeling of Alzheimer’s disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).
- Gotz, J., Ittner, L. M. Animal models of Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).
- Calhoun, M. E., et al. Neuron loss in APP transgenic mice. Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer’s disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Jean, Y. Y., et al. Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death. The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).
- Sotthibundhu, A., et al. Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).
- Kar, S., Quirion, R. Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer’s disease pathology. Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).
- Leranth, C., Frotscher, M. Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers. The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).
- Fa, M., et al. Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices. Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).
- Jin, M., et al. Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).
- Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2 (6), a006262 (2012).
- Chakrabarti, M., et al. Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration. Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Puzzo, D., et al. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).
- Puzzo, D., et al. Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory. Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Fulmer, C. G., et al. Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).
- Thakker-Varia, S., et al. The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).
- Greferath, U., et al. Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice. The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).
- Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band. Neuroscienze. 17 (2), 439-451 (1986).
- Clarke, D. J. Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study. Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).
- Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. Amyloid beta mediates memory formation. Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).
