Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.
Pankreatisk duktal adenokarcinom (PDAC) innehåller en delmängd av uteslutande tumörogena cancerstamceller (CSCS) som har visat att driva tumörinitiering, metastas och motståndskraft mot radio- och kemoterapi. Här beskriver vi en särskild metod för odling av primära humana pankreas CSCs som tumör sfärer i förankringsoberoende förhållanden. Celler odlas i serumfria, icke vidhäftande betingelser i syfte att anrika för CSCs medan deras mera differentierade avkommor inte överlever och prolifererar under den inledande fasen efter sådd av enskilda celler. Denna analys kan användas för att uppskatta procentandelen av CSCs närvarande i en population av tumörceller. Både storlek (som kan variera från 35 till 250 mikrometer) och antalet tumör sfärer bildade representerar CSC aktivitet hyste antingen bulk populationer av odlade cancerceller eller nyskördade och smält tumörer 1,2. Med hjälp av denna analys fann vi nyligen att metformin ablates selektivt pancreatic CSCs; ett konstaterande som senare bekräftas ytterligare genom att visa minskad expression av pluripotens associerade gener / ytmarkörer och minskad in vivo tumorigenicitet av metformin-behandlade celler. Som det sista steget för preklinisk utveckling vi behandlade möss med etablerade tumörer med metformin och fann signifikant förlängd överlevnad. Kliniska studier som testar användningen av metformin hos patienter med PDAC pågår (t.ex. NCT01210911, NCT01167738 och NCT01488552). Mekanistiskt, fann vi att metformin inducerar en dödlig energikris i CSCs genom att öka reaktiva syreradikaler (ROS) produktionen och minska mitokondriell transmembranpotentialen. Däremot var icke-CSCs inte elimineras genom metforminbehandling, utan snarare genomgick reversibel cellcykelstopp. Därför tjänar vår studie som ett framgångsrikt exempel på de möjligheter som in vitro sfär bildningen som en screeningmetod för att identifiera föreningar som potentiellt riktar CSCar, men kommer denna teknik att kräva ytterligare in vitro och di validerings vivo för att eliminera falska upptäckter.
Pankreatisk duktal adenokarcinom (PDAC) är en av de mest aggressiva fasta tumörer. Det är för närvarande den 4: e vanligaste cancerrelaterade dödsfall i det västerländska samhället och förutspås stiga till 2: a vanligaste orsaken inom de närmaste tio åren (~ 400.000 dödsfall per år i hela världen) 3 .Vid tidpunkten för diagnos 90% av patienterna som före med avancerad sjukdom, som har en 5-års överlevnad på mindre än 5%. Denna överlevnad har tyvärr varit oförändrad under de senaste 50 åren, trots allt intensivare forskningsverksamhet 4. Av de återstående 10% av patienterna som har potentiellt "botas" sjukdomen genom kirurgisk resektion, kommer 80% dör av återfall inom fem år. För många år standardbehandling för avancerad sjukdom har varit gemcitabin monoterapi, men detta endast ger en marginell överlevnadsfördel 5. Små förbättringar i kortsiktig överlevnad har uppnåtts genom tillsatsav erlotinib 6 eller capecitabin 7, men överlevnad är i storleksordningen veckor med medianöverlevnaden fortfarande ~ 6 månader. På senare tid har mer uppmuntrande resultat framkommit för gemcitabin / NAB -paclitaxel 8 och FOLFIRINOX kombinationsregimen 9,10. Dessa behandlingar förbättra medianöverlevnad med måttliga 2 och 4 månader respektive, men är mycket giftiga och långsiktiga överlevande är fortfarande ett sällsynt undantag. Även behandling ger potential för förbättringar, dessa är giftiga regimer som många patienter inte svarar eller endast visar stegvis förbättring i total överlevnad. Som en följd av detta finns det ett akut behov av att komplettera nuvarande terapier och att utveckla nya, troligen multimodala terapeutiska metoder.
Tumör Heterogenitet
Det blir allt mer uppenbart att cancer heterogenitet inte bara är begränsad till distinkta evolutionära subkloner within varje tumör 11, men också till följd av fenotypiska och funktionella heterogenitet och plasticitet inom varje subklon 12. Så kallade cancerstamceller (CSCS) eller tumörbefrämjande celler är ansvariga för intraclonal heterogenitet 13-16. Specifikt CSCs utgör en delmängd av cancercell, som vi och andra har lämnat avgörande bevis, ner till en enda cell, att de utgör roten till sjukdomen genom att ge upphov till alla differentierade avkommor inom varje cancer subklon 17. Ännu viktigare, dessa celler är nödvändiga för metastaserande beteende och också utgör en viktig källa för återfall efter behandling, även med relativt effektiva läkemedel som kan inducera initial tumörregression (t.ex. NAB -paclitaxel) 15,18-20. Det är viktigt att notera att CSCs inte nödvändigtvis representera bona fide stamceller, inte heller uppstår från vävnads stamceller i många fall, utan snarare har de ACQuired vissa funktioner i stamceller. De flesta av dessa är funktionellt definierade, exempelvis CSCs är utrustade med obestämd självförnyelse kapacitet gör dem resistenta mot konventionell kemoterapi, och visar ökad invasiv som främjar metastaserande aktivitet.
Funktionella Cancer Stem Cell Fenotyper
Den funktionella fenotypen av CSCs är baserat på deras förmåga att själv förnya, som kan testas in vitro med hjälp av serie sfär bildning och kolonibildningsanalyser respektive. Ännu viktigare, CSCs kan självförnyelse björn in vivo tumorigenicitet som kan testas genom begränsande utspädning in vivo som den ultimata funktionella avläsning, företrädesvis under serie transplantation indikerar exklusiva långtids tumorigenicitet. Dessutom finns det heterogenitet inom CSC utrymmet, med en distinkt underpopulation av CSCs försedda med exklusiv förmåga att ge upphov till metastaser som inte bara är endirekt följd av deras exklusiva in vivo tumorigenicitet. I själva verket, metastastitic CSCs förvärva förmågan att kringgå den primära tumören, överleva anoikis och så småningom translokerar och utsäde sekundära platser. Dessa avancerade funktionsförmåga kan testas in vitro med användning av modifierade invasionsanalyser och in vivo med hjälp av metastaser analyser.
Inriktning cancerstamceller
Vi och andra har gett övertygande bevis för att behandling med fokus på bulk tumör i differentierade PDAC celler, även i kombination med stroma-målsökande medel, inte har en stor inverkan på tumörprogression och efterföljande utfall inte kombineras med en CSC-inriktning strategi 21, 22. Således, baserat på de viktiga funktionerna i CSCs i sjukdomsprogression och resistens mot behandling, bör dessa celler innebära en väsentlig komponent för varje ny behandlingsform 18,20, men kommer att kräva en mycket mer grundlig förståelse of reglerings maskineri CSCs. Även CSCs och deras mer differentierade avkommor bära identiska genetiska grundtillstånd med avseende på genetiska förändringar, CSCs uppvisar tydliga och därmed epigenetiskt bestämda genuttryck profiler som delar moduler med pluripotenta stamceller. De flesta av de inblandade i genere inducerade pluripotenta stamceller (NANOG, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) gener har bara inte kopplats till cancer, men deras uttryck är oftast begränsad till CSCs facket. Dessutom har den funktionella betydelsen av CSCs genom förlust-of-funktion experiment med genetiska verktyg för att rikta CSCs nu etablerat CSC koncept för flera cancertyper 23-25. Medan de flesta av dessa metoder är baserade på musmodeller och därmed inte lätt kan överföras till kliniken, de ger proof-of-concept för den potentiella kliniska relevansen av inriktning CSCs i kombination med bulktumörceller.
Studera cancerstamceller i Vitro att identifiera sina akilleshäl
För att identifiera nya och kliniskt tillämpliga sätt för att rikta CSCs är deras funktioner regelbundet studerade in vitro och sfär bildning används ofta i detta sammanhang. Utvecklades ursprungligen för att studera normal stamcellsbiologi, inklusive självförnyelse och differentiering kapacitet, var denna analys anpassades senare för att studera CSCs in vitro och har använts för att undersöka CSCs isolerade från PDAC 20. Vi har funnit att tumör sfärer bildade från primära humana PDAC celler stå för alla olika funktioner i CSCs, vilket tyder på att de innehåller bona fide bukspottkörteln CSCs 21. Således representerar tumörområdet analysen ett kraftfullt verktyg för att screena för effektivare behandlingsmetoder in vitro, men resultaten måste utvärderas ytterligare på strängare in vivo. Faktum är att data som genereras med detta in vitro bör behandlas med stor försiktighet eftersom the-analysen kan bli föremål för betydande fel. Mycket standardiserade protokoll, inklusive automatisk räkning av formade sfärer, bör inrättas för att säkerställa reproducerbara och prediktiva data.
I detta sammanhang använde vi nyligen denna analys för att screena bukspottkörteln CSCs härrör från en mångfald av primära humana PDACs och visade att dessa celler är mycket känsliga för metabolisk omprogrammering av anti-diabetesförening metformin. Tidigare hade metformin visats hämma cancerceller expansion genom indirekt aktivering av AMP-aktiverat proteinkinas (AMPK) signalering och efterföljande hämning av mTOR 26, vilket resulterar i minskad proteinsyntes och celltillväxt 27. Utöver dessa effekter på bulktumör befolkningen, har vi och andra funnit att metformin kan rikta och faktiskt eliminera CSCs subpopulation i ett antal fasta tumörer såsom bröst-, matstrupscancer, glioblastom och pankreascancer 28-31 </ Sup>. Således representerar metformin en lovande och säker ny terapeutisk strategi för flera cancerformer med för närvarande stora medicinska behov. Dessutom använder sfär bildning som ett sätt att berika för CSCs, visade vi att metformin primära effekter på bukspottkörteln CSCs var oberoende av AMPK aktivering och förlitade sig främst på sin blygsamma mitokondriell toxicitet (via hämning av komplex I), som uppenbarligen var dödlig för delmängd av CSCs endast. För den senare kunde vi bedöma deras cellulära syreförbrukning och mitokondrie ROS produktion som indikatorer på läkemedlets toxicitet på cellnivå. Därefter kan dessa in vitro-data valideras i prekliniska musmodeller och faktiskt resulterat i signifikant förlängd överlevnad 31. Den metod som presenteras här möjliggör snabb generering av läkemedelskänslighetsprofiler för CSCs, inklusive studier av deras effekt på CSC metabolism. Vi har nu ger utökad experimentella detaljer om den utnyttjade completterande in vitro och in vivo-förfaranden.
Med framväxten och efterföljande validering av CSC koncept för många tumörer, har området läkemedelsutveckling fått ny fart, med potential för att utveckla mer effektiva cancerbehandlingar och därefter minska risken för återfall. Dock är CSC fältet fortfarande i ett tidigt skede och mer måste uppnås när det gäller förståelsen CSC ursprung och utbredning, och deras roll i att forma tumör arkitektur och främja metastaser.
I detta sammanhang bör användningen av reproducerbara och meningsfulla CSC analyser samt informerade tolkning av erhållna data representerar en viktig komponent för att öka kunskaperna om CSC biologi. Från många biologiska perspektiv har sfär bildning vuxit fram som en mycket värdefull analys; ändå användare bör vara medveten om sina begränsningar för att korrekt tolka sina experimentella resultat. En viktig aspekt att beakta även innan utvärderingen av sfären formationsuppgifter är ursprunget till den undersökta provet, eftersom de resultat som erhållits från färska patientgenererade prover kan vara betydligt annorlunda än de som erhålls från etablerade cancercellinjer.
Klassiska sphere bildnings analyser innefattar ympning celler vid klonal densitet i ultralåg-fastsättningsplattor och utvärdera sfär bildning i närvaro av epidermal tillväxtfaktor (EGF) och / eller basisk fibroblasttillväxtfaktor (b-FGF) anrikad, men serumfritt medium 21, 34. Odlingsmediet sammansättning är också en viktig fråga att överväga. Enligt vår erfarenhet visade det sig att den DMEM / F12 kompletterat med B27, bFGF och glutamin i frånvaro av serum var ett optimalt medium för att växa, utvidga och bibehålla CSC i odifferentierade tillstånd. Vi fann att i denna kultur skick (medium och hjulupphängningen) cellerna uttrycker höga halter av cancerstamcellsmarkörer (inklusive CD133 +, CD44 + och CD24 +) och inte uttrycker differentieringsassocierade proteiner (CK-20 Och CK-19).
En av de grundläggande antaganden för dessa analyser är att varje sfär är klonal, dvs resultatet en sfär från utbyggnaden av en enda stamcell. Emellertid sfärer är inneboende dynamiska strukturer som är benägna att smälta även vid låg såddtäthet 35. Bordläggningen celler är ett kritiskt steg i protokollet och densiteten av en cell / brunn kan säkert kringgå aggregering frågan. Men även för prospektivt sorterade progenitorer regelbundet resulterar detta i mycket låga sfär bildning på grund av låg inre sfär bildning aktivitet och kan också tillskrivas begränsad autokrin stimulering på grund av utspädningseffekter. Enligt vår erfarenhet observerade vi att endast 30% av celler pläterade kan bilda sfärer. Vi rekommenderar att du använder åtminstone 100 celler / brunn för att få konsekventa och reproducerbara resultat.
Andra odlingsmetoder för tillväxt CSC är baserade på fasta eller halvfasta 3D kulturer (t.ex., baserat på matrigel, kollagen eller metylcellulosa). Dessa metoder har använts för att begränsa cellrörlighet och efterföljande cellaggregation 36. Var och en av dessa matriser bär sina egna begränsningar. Till exempel är matrigel en löslig basalmembran isoleras från Engelbreth-Holm-Swan (EHS) tumör och även om extrakt liknar den komplexa extracellulära tumörmiljön som finns i många vävnader, gör den innehålla flera mer eller mindre specifika tillväxtfaktorer som ofta gör mekanistisk studier för specifika regulatoriska element mycket svårt. En annan plats av övervägande är att sfärbildande förmåga och stamcells funktioner är inte utbytbara termer 34. Medan vissa stam- och stamfaderceller har visats uppvisa sfär bildande förmåga 37, fel att generera sfärer in vitro utesluter inte in vivo-stam / stamfaderfunktion. Exempelvis kan inaktiva stamceller helt enkelt inte svarar på de extracellulära signaler som tillhandahålls avvald in vitro odlingsbetingelser. Således långsiktig in vitro och in vivo självförnyelse kapacitet renade cellpopulationer, företrädesvis under seriepassage, skall bedömas för att bevisa eller motbevisa stamcellsfunktion. I detta sammanhang är förmågan att prospektivt och samtidigt propagera olika populationer av stam- och progenitorceller en viktig aspekt av sfären bildande analysen och gör denna analys mycket värdefull för CSC fältet; så länge som dess begränsningar hålls i åtanke för tolkning av de erhållna data.
Sphere bildande analyser har använts i stor utsträckning för att i efterhand identifiera stamceller baserat på deras förmåga att självförnyelse och differentiering på enskild cellnivå in vitro. Upptäckten av markörer som gör den blivande isolering av stamceller och deras avkomma från sin in vivo nisch kan de funktionella egenskaperna hos renade populationer som skall fastställas. Combination av sfär bildningsanalys och FACS är en framgångsrik strategi för att isolera celler från fast vävnad eller berika specifika subpopulationer av PDAC i kultur. Till exempel definierar samtidigt uttryck av EpCAM, CD24 och CD44 en subpopulation av CSCs kunna: självförnyelse, differentiera och initiera en tumör, vilket återspeglar heterogenitet den ursprungliga tumören. Hermann et al., visade att CD133 + celler hade förstärkt fortplantningsförmågan och CSC har 15. Andra markörer har också använts för karakterisering av CSCs: ALDH- 1 (aldehyddehydrogenas-1) uttryck associeras med mycket tumorigena celler i pankreascancer 38; celler som kan utesluta DNA färgämnet Hoechst 33342, som heter sido befolkning (SP) celler, har bevisade förmåga att initiera tumörer 39. Nyligen visade att en subcellulär autofluorescens fack kännetecknar en distinkt population av humana celler med exklusiva CSC egenskaper på olika tumörtyper40. Även om ingen av dessa markörer verkar selektivt karakterisera en ren population av CSCs, mer och mer komplexa kombinationer av markörer måste användas till FACS rena mer förfinade populationer av celler.
Många frågor kvarstår om den exakta roll CSCs i ursprung, progression och läkemedelsresistens av tumörer. Till exempel, ett sätt att ta itu med frågan om klonal evolution att definiera om och hur en enda CSC initierar en tumör, skulle kunna vara att analysera patientprover i olika skeden av sjukdomen, och särskilt följa antalet CSCs under och efter behandlingen. Genom att svara på dessa frågor, kan vi göra meningsfulla framsteg i vår kunskap om CSCs i solida tumörer och utveckla läkemedelsbehandlingar för att slutligen förebygga tumörprogression och återfall.
The authors have nothing to disclose.
Den nuvarande forskning stöds av en ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233.460), Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7 / 2007-2013) enligt bidragsavtal nr 256.974 (EPC-TM-NET) och nr 602.783 (CAM-PAC ), varvid Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 & PI12 / 02643), och Prog Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien). E. Lonardo stöddes av Roche Fellowship. M. Cioffi stöddes av La Caixa Predoctoral Fellowship Programme.
Counting Chamber/Hemocytometer | Hausser Scientific Co | 3200 | |
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement | Roche Innovatis | AG CASY Model TTC 45,60,150 μm | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyi Co | 130-093-235 | |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Co | 130-093-237 | |
24-well Ultra-low Attachment Plates | Corning | 3474 | |
100-mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353803 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
15-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml sterile tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
50 ml centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Sterile petri dishes, 10 cm dishes | Corning | 353003 | |
26G needles | BD Falcon | 300600 | |
100 ul Hamilton Syringe | Hamilton Syringe Co | 81075 | |
Collagenase type IV | Stem Cell Technologies | 7909 | |
RPMI Medium 1640 | Life technologies | 11875-085 | |
Penicillin/Streptomycin solution, 100X | Life technologies | SV30010 | |
Metformin | Sigma | D150959-5G | |
L-glutamine, 200 mM, 100X | Life technologies | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
100mM Sodium Pyruvate solution | Life technologies | 11360-070 | |
Seahorse Assay medium | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive | BD Biosciences | 354240 | |
Trypsin solution, 0.05% | Life technologies | 25300054 | |
B27 Supplement 50x | Life technologies | 17504-044 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | Sigma | F0291 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9576 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Sigma | D8437 | |
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Trypan Blue | Life technologies | 15250-061 | |
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) | Life technologies | C-369 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Ethanol 70% (vol/vol) | Sigma | 459844 | |
Isofluorane | IsoVet, Braun | 571105.8 | |
Matrigel | BD Biosciences | 35620 | |
Sterile Cotton tipped applicator | Puritan medical | ||
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
XF96e Extracellular Flux analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Incubator with CO2 input | |||
Micro scissors | |||
Curved forceps | |||
Splinter forceps | |||
Caliper |