高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em>その場での</em>ハイブリダイゼーション

軸索のmRNAの募集とローカル翻訳は、時間的および空間的に急性様式¹に細胞外刺激に応答する軸索を可能にします。イントラ軸索タンパク質合成は、最良の軸索は^、9-11を経路探索し、逆行^{12,13シグナリング} 、それは成長円錐の動作^2-8において重要な役割を果たしている神経発達の文脈で理解されています。軸索のmRNAとリボソームのレベルが大幅に^14,15に減少している場合にははるかに少ないが、ポスト発達神経細胞における軸索タンパク質合成の機能的意義について知られています。成熟した脊椎動物の軸索は、長い¹⁶翻訳不活性であると考えられてきました。しかし、最近の研究では、地元の翻訳は、病理学的条件の下で成熟した軸索に再活性化されることを示しています。例えば、mRNAのサブセットは、神経損傷およびイントラ軸索タンパク質合成は、これらの軸索¹⁷の正確な再生のために必要とされる以下の再生軸索に補充されます。さらに、当社グループヘクタールSは、特定のmRNAがアルツハイマー病ペプチド_Aβ1-42へのローカルの暴露後に軸索に動員されることを実証し、転写因子ATF4のローカル翻訳は軸索のニューロンの細胞体¹⁸への_Aβ1-42の神経変性作用を伝播するために必要です。最後に、ハイスループット分析は、成熟した軸索は、特に病理学的条件下で^、18-21予想以上に複雑で動的なトランスクリプトームを持っていることを明らかにしました。これらの研究に照らして、成体の神経系において軸索局在化するmRNAを検出するための高感度かつ特異的な方法が必要とされています。

成熟した軸索におけるmRNA動員およびローカル翻訳の作業の多くは培養ニューロンに行われています。特殊な培養方法はsomato樹状区画^18-20からの軸索の単離を可能にする存在するため、トランスクリプトーム解析のために、これは特にそうです。このような研究は、貴重なインを与えているが、成熟した軸索の現地翻訳の役割にIGHTは、培養神経細胞を忠実に生体内でまたはmRNAの募集は、培養条件への軸索の適応応答である場合は、状況を表しているかどうかの質問はまだ開いています。いくつかの研究は、in vivoで軸索を成熟mRNAの動員の証拠を提供しました。例えば、嗅覚マーカータンパク質をコードする転写物は、成人の感覚ニューロンにおける軸索²²で検出されています。 βアクチンのmRNAの3 'UTRを含む導入遺伝子は、マウスにおいて、末梢および中枢神経系ニューロンにおける軸索に輸送され、局所的に発達期間²³の後に翻訳されます。ラミンB2 mRNAはXenopuesにおける網膜軸索に局在しているオタマジャクシをアフリカツメガエル、その枯渇は軸索の開発²¹た後、軸索の維持に影響を与えます。チトクロームCオキシダーゼIVをコードするmRNAの軸索輸送との干渉は、マウスの動作^24を変化させます。最後に、ATF4 mRNAが成人aで発見されました_Aβ1-42との関連で、マウスとヒトの脳のxonsは、神経変性^18を誘発しました。

ハイスループットのトランスクリプトーム分析は、 インビトロで 、単離された軸索中のmRNAプロファイルを同定するために有用であることが証明さが、全体の組織の軸索における以降のインビボ研究は単独で見つからないが、神経細胞体、グリア細胞および他の細胞型と混在んために限界があるています。したがって、このような分析は、mRNAの細胞内局在を確認する画像技術と組み合わせされなければなりません。 in situハイブリダイゼーション （RNA ISH） における RNAは、細胞および組織中の特定のRNA配列の検出および視覚化を可能にします。ただし、元のRNA ISHアッセイは、まれにしか軸索ローカライズされたmRNAのためのケースではありません非常に豊富RNAを²⁵の同定に適していました。努力を増加させる最後の数十年のために、単一分子レベルでのmRNAの検出を可能にする新たな技術の開発に置かれています<suP> 25,26。例えば、歌手らは5蛍光非重複50マーを（詳細は²⁷を参照）、標識されたことからなる、単一細胞でのmRNAを検出するためのISHプローブを開発しました。上記の技術と、ここで説明したものとの主な違いは、後者は20ダブルZ-構造（ないリニア）は、典型的には、関心を保証する特異性と低いバックグラウンドレベルのRNAの約1 kbの領域を標的プローブを使用していることです。プローブは、最終的に蛍光標識または発色反応を可能にする酵素と結合しているプリアンプやアンプの配列とハイブリダイズさせます。これらの増幅ステップは、他のISH技術²⁸に比べて、信号対雑音比を改善します。ここでは、蛍光免疫細胞化学または軸索対比を可能にする組織学的染料のいずれかを組み合わせRNAscopeを使用して2つのプロトコルを記述します。両方のプロトコルは、大人のMOにATF4 mRNAの軸索の局在を可視化するのに適しています使用して、人間の脳。