איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em> באתר</em> הכלאה
Summary
RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
Abstract
mRNAs לעתים קרובות מקומי לאקסונים חוליות והתרגום המקומי שלהם נדרש לpathfinding האקסון או הסתעפות בפיתוח ותחזוקה, תיקון או ניוון של מערכת עצבים בתקופות postdevelopmental. ניתוחי תפוקה גבוהים חשפו לאחרונה כי יש לי האקסונים transcriptome יותר דינמית ומורכבת יותר מהצפוי בעבר. ניתוח אלה, עם זאת כבר נעשה בעיקר בנוירונים בתרבית שבו ניתן לבודד האקסונים מתאי somato-הדנדריטים. זה כמעט בלתי אפשרי להשיג בידוד כזה ברקמות שלמות in vivo. לפיכך, על מנת לאמת את הגיוס של mRNAs ורלוונטי הפונקציונלי שלהם בכל בעלי חיים, צריכים להיות משולבים באופן אידיאלי ניתוחי transcriptome עם טכניקות המאפשרות ההדמיה של mRNAs באתר. לאחרונה, טכנולוגיות ISH רומן המזהות RNAs ברמת מולקולה בודדת פותחו. זה חשוב במיוחד בעת ניתוח לוקליזציה subcellular של mRNA, RNAs המקומי מאז נמצא בדרך כלל ברמות נמוכות. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים לצורך זיהוי של mRNAs axonally-מקומי באמצעות טכנולוגית RNA ISH רומן רגישה. יש לנו שילוב RNAscope ISH עם counterstain axonal באמצעות אימונוהיסטוכימיה הקרינה או צבעים היסטולוגית כדי לאמת את הגיוס של Atf4 mRNA לאקסונים in vivo בעכבר הבוגר והמוח אנושי.
Introduction
גיוס mRNA axonal ותרגום מקומי לאפשר האקסונים להגיב לגירויים תאיים באופן 1 באופן זמני ומרחבית חריפה. סינתזת חלבון תוך-axonal היא הדרך הטובה ביותר להבין בהקשר של התפתחות המוח שבו משחק תפקידים מכריעים בצמיחה חרוט התנהגות 2-8, האקסון מפלס-הדרך 9-11 ומדרדר איתות 12,13. אבל הרבה פחות ידוע על המשמעות התפקודית של סינתזת חלבון axonal בתאי עצב פוסט-התפתחותית כאשר רמות ה- mRNA והריבוזום axonal מופחתות 14,15 מאוד. האקסונים חוליות בוגרים כבר מזמן חשבו להיות translationally פעיל 16. עם זאת, המחקרים אחרונים מצביעים על כך שהתרגום מקומי מחדש באקסונים בוגרים תחת מצבים פתולוגיים. לדוגמא, קבוצת משנה של mRNAs מגויס לאקסונים התחדשות הבאה פגיעה עצבית וסינתזה של חלבונים תוך-axonal נדרשים להתחדשות הנכונה של אקסונים אלה 17. בנוסף, חה הקבוצה שלנוים הוכיח כי mRNAs הספציפי מגויסים לאקסונים לאחר חשיפה מקומית לפפטיד מחלת אלצהיימר Aβ 1-42, ותרגום המקומי של ATF4 גורם השעתוק נדרשת כדי להפיץ את השפעות ניווניות של Aβ 1-42 מן האקסונים לסומה העצבית 18. לבסוף, ניתוחי תפוקה גבוהים גילו כי יש לי האקסונים בוגרים transcriptome יותר מורכבת ודינמית מהצפוי 18-21, במיוחד בתנאים פתולוגיים. לאור המחקרים הללו, שיטה רגישה וספציפית מאוד כדי לזהות mRNAs axonally מקומי במערכת העצבים הבוגרת יש צורך.
חלק גדול מהעבודה על גיוס mRNA ותרגום מקומי באקסונים בוגרים שבוצע על נוירונים בתרבית. זה נכון במיוחד עבור transcriptome ניתוחים מאז שיטות culturing מיוחדות קיימות המאפשרות הבידוד של אקסונים מהתא הדנדריטי somato-18-20. למרות שמחקרים כאלה ניתנו תוספות יקרותight לתוך התפקיד של תרגום המקומי באקסונים בוגרים, השאלה אם נוירונים בתרבית מייצגים נאמנה את המצב בvivo או אם גיוס mRNA הוא תגובה אדפטיבית של אקסונים לתנאי culturing עדיין פתוח. מחקרים מעטים סיפקו ראיות לגיוס mRNA להבשיל האקסונים in vivo. לדוגמא, תמליל קידוד לחלבון סמן חוש הריח זוהה באקסונים בתאי עצב תחושתיים מבוגרים 22. Transgene המכיל 'UTR 3 של mRNA β-אקטין מועבר לאקסונים בתאי עצב במערכת עצבים היקפיים ומרכזיים בעכברים ומתורגם באופן מקומי לאחר תקופות התפתחותיות 23. B2 Lamin mRNA הוא מקומי לאקסונים רשתית בXenopues laevis ראשנים ודלדולה משפיע תחזוקת האקסון לאחר פיתוח axonal 21. הפרעה לתחבורה axonal של קידוד mRNA לIV מונואמין ציטוכרום C משנה עכבר התנהגות 24. לבסוף, Atf4 mRNA נמצא במבוגריםxons של עכברים ומוח אנושי בהקשר של Aβ 1-42 -induced ניוון מוחיים 18.
ניתוחי transcriptome תפוקה גבוהה הוכיחו להיות שימושי כדי לזהות פרופילי mRNA באקסונים מבודדים במבחנה אבל יש מגבלות במחקרי vivo מאז בכל רקמות האקסונים לא נמצאים בבידוד, אבל התערבבו עם גופים עצביים תא, תאי גלייה וסוגי תאים אחרים. לפיכך, ניתוח כזה צריך להיות משולב עם טכניקות הדמיה שלאשר את לוקליזציה subcellular של mRNAs. RNA הכלאה באתר (RNA ISH) מאפשר זיהוי והדמיה של רצפי RNA ספציפיים בתאים וברקמות. עם זאת, מבחני RNA ISH המקוריים היו מתאימים רק לזיהוי RNAs הנרחב ביותר 25, שהוא לעתים רחוקות במקרה של mRNAs המקומי axonally. לעשורים האחרונים גוברים מאמצים כבר הכניס לתוך טכנולוגיות חדישות פיתוח המאפשרות זיהוי של mRNAs ברמת המולקולה בודדת <sup> 25,26. לדוגמא, זינגר ועמיתיו פיתחו בדיקות ISH לזהות mRNAs בתאים בודדים, הכוללים 5 שאינם חופף שכותרתו fluorescently 50 מרס (לפרטים עיינו 27). ההבדל העיקרי בין השיטות שהוזכרו לעיל ואחד כאן תאר הוא שמאוחר יותר משתמש 20 Z-מבנה כפול (לא ליניארי) בדיקות, כי בדרך כלל היעד ~ אזור KB 1 של ה- RNA של הספציפיות הבטחת ריבית ורמות רקע נמוכות. אז בדיקות הם הכלאה עם רצפי מגבר קדם מגבר שסופו של דבר כותרת או מצומדות עם אנזימים המאפשרים תגובות chromogenic fluorescently. צעדי הגברה אלה משפרים את יחס אות לרעש בהשוואה לטכנולוגיות אחרות ISH 28. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים באמצעות RNAscope בשילוב גם עם immunocytochemistry הקרינה או עם צבעים היסטולוגית מאפשרים counterstaining axonal. שני הפרוטוקולים מתאימים לדמיין לוקליזציה axonal של Atf4 mRNA במו הבוגרלהשתמש ומוח אנושי.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדוח זה אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית ISH ברזולוציה גבוהה בזיהוי של mRNA Atf4 המקומי axonally. מחקרים שפורסמו אלה וקודמים הראו כי טכנולוגיה זו היא תואמת עם זיהוי חלבון מבוסס נוגדנים ברקמות או אפילו עובר כל 33. חשוב לציין, זה כבר היה בשימוש לאחרונה לגילוי Arc mRNA ב…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
Materials
| custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
Riferimenti
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
- Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
- Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
- Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506 (2014).
- Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
- Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
- Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
- Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
- Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
- Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
- Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
- Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
- Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
- Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079 (2012).
- Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
- Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
- Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
- Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
- Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
- Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55 (2014).
- Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
