איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em> באתר</em> הכלאה

גיוס mRNA axonal ותרגום מקומי לאפשר האקסונים להגיב לגירויים תאיים באופן ¹ באופן זמני ומרחבית חריפה. סינתזת חלבון תוך-axonal היא הדרך הטובה ביותר להבין בהקשר של התפתחות המוח שבו משחק תפקידים מכריעים בצמיחה חרוט התנהגות ^2-8, האקסון מפלס-הדרך ^9-11 ומדרדר איתות ^12,13. אבל הרבה פחות ידוע על המשמעות התפקודית של סינתזת חלבון axonal בתאי עצב פוסט-התפתחותית כאשר רמות ה- mRNA והריבוזום axonal מופחתות ^14,15 מאוד. האקסונים חוליות בוגרים כבר מזמן חשבו להיות translationally פעיל ^16. עם זאת, המחקרים אחרונים מצביעים על כך שהתרגום מקומי מחדש באקסונים בוגרים תחת מצבים פתולוגיים. לדוגמא, קבוצת משנה של mRNAs מגויס לאקסונים התחדשות הבאה פגיעה עצבית וסינתזה של חלבונים תוך-axonal נדרשים להתחדשות הנכונה של אקסונים אלה ^17. בנוסף, חה הקבוצה שלנוים הוכיח כי mRNAs הספציפי מגויסים לאקסונים לאחר חשיפה מקומית לפפטיד מחלת אלצהיימר Aβ _1-42, ותרגום המקומי של ATF4 גורם השעתוק נדרשת כדי להפיץ את השפעות ניווניות של Aβ _1-42 מן האקסונים לסומה העצבית ^18. לבסוף, ניתוחי תפוקה גבוהים גילו כי יש לי האקסונים בוגרים transcriptome יותר מורכבת ודינמית מהצפוי ^18-21, במיוחד בתנאים פתולוגיים. לאור המחקרים הללו, שיטה רגישה וספציפית מאוד כדי לזהות mRNAs axonally מקומי במערכת העצבים הבוגרת יש צורך.

חלק גדול מהעבודה על גיוס mRNA ותרגום מקומי באקסונים בוגרים שבוצע על נוירונים בתרבית. זה נכון במיוחד עבור transcriptome ניתוחים מאז שיטות culturing מיוחדות קיימות המאפשרות הבידוד של אקסונים מהתא הדנדריטי ^{somato-18-20.} למרות שמחקרים כאלה ניתנו תוספות יקרותight לתוך התפקיד של תרגום המקומי באקסונים בוגרים, השאלה אם נוירונים בתרבית מייצגים נאמנה את המצב בvivo או אם גיוס mRNA הוא תגובה אדפטיבית של אקסונים לתנאי culturing עדיין פתוח. מחקרים מעטים סיפקו ראיות לגיוס mRNA להבשיל האקסונים in vivo. לדוגמא, תמליל קידוד לחלבון סמן חוש הריח זוהה באקסונים בתאי עצב תחושתיים מבוגרים ^22. Transgene המכיל 'UTR 3 של mRNA β-אקטין מועבר לאקסונים בתאי עצב במערכת עצבים היקפיים ומרכזיים בעכברים ומתורגם באופן מקומי לאחר תקופות התפתחותיות ^23. B2 Lamin mRNA הוא מקומי לאקסונים רשתית בXenopues laevis ראשנים ודלדולה משפיע תחזוקת האקסון לאחר פיתוח axonal ^21. הפרעה לתחבורה axonal של קידוד mRNA לIV מונואמין ציטוכרום C משנה עכבר התנהגות ^24. לבסוף, Atf4 mRNA נמצא במבוגריםxons של עכברים ומוח אנושי בהקשר של Aβ _1-42 -induced ניוון מוחיים ^18.

ניתוחי transcriptome תפוקה גבוהה הוכיחו להיות שימושי כדי לזהות פרופילי mRNA באקסונים מבודדים במבחנה אבל יש מגבלות במחקרי vivo מאז בכל רקמות האקסונים לא נמצאים בבידוד, אבל התערבבו עם גופים עצביים תא, תאי גלייה וסוגי תאים אחרים. לפיכך, ניתוח כזה צריך להיות משולב עם טכניקות הדמיה שלאשר את לוקליזציה subcellular של mRNAs. RNA הכלאה באתר (RNA ISH) מאפשר זיהוי והדמיה של רצפי RNA ספציפיים בתאים וברקמות. עם זאת, מבחני RNA ISH המקוריים היו מתאימים רק לזיהוי RNAs הנרחב ביותר ^25, שהוא לעתים רחוקות במקרה של mRNAs המקומי axonally. לעשורים האחרונים גוברים מאמצים כבר הכניס לתוך טכנולוגיות חדישות פיתוח המאפשרות זיהוי של mRNAs ברמת המולקולה בודדת <sup> 25,26. לדוגמא, זינגר ועמיתיו פיתחו בדיקות ISH לזהות mRNAs בתאים בודדים, הכוללים 5 שאינם חופף שכותרתו fluorescently 50 מרס (לפרטים עיינו ^27). ההבדל העיקרי בין השיטות שהוזכרו לעיל ואחד כאן תאר הוא שמאוחר יותר משתמש 20 Z-מבנה כפול (לא ליניארי) בדיקות, כי בדרך כלל היעד ~ אזור KB 1 של ה- RNA של הספציפיות הבטחת ריבית ורמות רקע נמוכות. אז בדיקות הם הכלאה עם רצפי מגבר קדם מגבר שסופו של דבר כותרת או מצומדות עם אנזימים המאפשרים תגובות chromogenic fluorescently. צעדי הגברה אלה משפרים את יחס אות לרעש בהשוואה לטכנולוגיות אחרות ISH ^28. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים באמצעות RNAscope בשילוב גם עם immunocytochemistry הקרינה או עם צבעים היסטולוגית מאפשרים counterstaining axonal. שני הפרוטוקולים מתאימים לדמיין לוקליזציה axonal של Atf4 mRNA במו הבוגרלהשתמש ומוח אנושי.