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Immunologia e infezioni

'마스트 셀 노크-인' 마우스를사용 하 여 생체 내 비만 세포의 기능 분석

Published: May 27, 2015
doi:
10.3791/52753
, , , , ,
1Department of Pathology,Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology,Stanford University School of Medicine

Summary

우리는 체외 유래 마스트 세포의 생성을 위한 방법, 유방 세포 결핍 마우스로그들의 이식, 및 다른 해부학 적인 사이트에 이식된 유방 세포의 표현형, 숫자 및 분포의 분석을 기술합니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 마스트 세포의 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

비만 세포 (MC)는 다양한 조직에 상주하는 조혈 세포이며, 특히 피부, 기도 및 위장관과 같은 외부 환경에 노출 된 부위에 풍부합니다. IgE 의존성 알레르기 반응에서 해로운 역할로 가장 잘 알려진 MC들은 독과 침입 하는 박테리아와 기생충에 대 한 호스트 방어에 중요 한 선수로 등장 했다. MC 표현형 및 기능은 해부학적 위치에 따라 다를 수 있는 미세 환경적 요인및/또는 면역 반응의 발달의 유형 또는 단계에 따라 영향을 받을 수 있다. 이러한 이유로, 우리와 다른 MC 기능에 대 한 통찰력을 얻기 위해 체 외 메서드를 통해 생체 내 접근에 선호 했다. 여기서는 마우스골수 유래 배양MC(BMCMC), 유전자 MC-결핍 마우스로의 입양 이송, 양상에서 입양된 MC의 수 및 분포 분석 등을 설명하고 있다. ‘마스트 셀노크인’ 접근법이라는 이름의 이 방법은 지난 30년 동안 MC와 MC 파생 제품의 기능을 생체내에서평가하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 우리는 최근 몇 년 동안 개발 된 대체 접근 방식에 비추어이 방법의 장점과 한계에 대해 논의합니다.

Introduction

비만 세포(MC)는 다능성 골수선조1-3에서발생하는 조혈 세포이다. 골수 회귀에 이어 MC들은 지역성장인자의영향으로 성숙한 MC로 발전하는 다양한 조직으로 이주한다. 조직 거주자 MC는 피부, 기도 및 위장관과 같은 호스트 환경 인터페이스에 전략적으로 위치하며, 외부 모욕에 대한 방어의 첫 번째 선으로행동합니다 3-6. MC는 종종 자신의 “기준”표형 특성과 해부학 위치에 따라 하위 분류된다. 마우스에서는 MC의 두 가지 유형이 설명되었습니다 : “결합 조직 형” MC (CTMC) 및 점막 MC (McC)1-3,7,8. CTMC는 종종 정맥 과 신경 섬유 근처에 위치하고, 혈청 구멍에 거주, MmCs는 창자 및 호흡점막1-3의상피 위치를 차지하는 동안.

9-13MC의생물학적 기능을 연구하기 위해 수많은 방법론이 적용되었다. 많은 그룹은 세포주(인간 MC 라인 HMC114 또는 LAD215,16)를사용하여 체외 접근법에 초점을 맞추고 있으며, 체외 유래 MC(예: 인간 말초 혈액 유래 MC17)또는 마우스 골수 유래 배양MC [BMCMC]18,태아 피부 유래 배양 MC [FSCmC]19 및 수막 세포 유래 MC [PCMC]20)또는 다른 해부학 적 사이트에서 전 생체 외 격리 MC. 이러한 모든 모델은 MC 활성화에 관여하는 신호 경로와 같은 MC 생물학의 분자 세부 사항을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 그러나, MC 생물학의 중요한 측면은 그들의 표현성 및 기능적특성(예를 들어,세포질 과립 프로테아제 함량 또는 다른 자극에 대한 반응)이 해부학적 위치 및 미세환경에 의해 변조될 수 있다는 것이다2,7. 생체 내에서 발생하는 이러한 요인의 정확한 혼합물은 시험관 내에서재현하기 어려울 수 있기 때문에, 우리는 MC 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 생체 내 접근 방식을 사용하는 것을선호9.

널리 사용되는 WBB6F1–키트 W/W-v 또는 C57BL/6-키트 W-sh/W-sh 마우스와 같은 유전 MC 결핍을 가진 몇몇 마우스 긴장이 존재합니다. 이들 마우스는 KIT(CD117)의 발현 및/또는 활성이 부족하며, 주 MC 성장 인자 줄기 세포 인자(SCF)21,22에대한 수용체가 부족하다. 그 결과, 이들 마우스는 심오한 MC 결핍을 가지고 있지만, 또한c-키트 돌연변이(WBB6F1-키트 W/W-v 마우스)와 관련된 추가적인 표현성 이상이 있거나 큰 염색체 반전의 영향으로 c-키트 발현(C57BL/6-키트 W-sh/W-sh/W-sh)을 감소시키는 효과가 있다. 최근에는c-kit-독립적인구성 MC 결핍을 가진 마우스의 몇몇 변종은24-26보고되었다. 이러한 모든 마우스와 유도 할 수없는 MC-결핍 마우스의 몇 가지 추가 새로운 유형은 최근 자세히 검토되었습니다9,10,13.

여기서는 마우스골수 유래 배양형 MC(BMCMC) 생성, MC-결핍 마우스로의 입양 전달, 양상분석, 양상분석 등의 방안을 설명하고 있다. 이른바 ‘마스트 셀 노크인’ 방법을 사용하여 MC및 MC 파생 제품의 기능을 생체 내에서 평가할 수 있다. 우리는 최근 몇 년 동안 개발 된 대체 접근 방식에 비추어이 방법의 장점과 한계에 대해 논의합니다.

Protocol

모든 동물 관리 및 실험은 건강의 국가 학회의 지침과 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 특정 승인을 준수하여 수행되었다. 1. 골수 유래 배양 돛대 세포의 생성 및 특성화 (BMCMC). 참고: 기증자 BMCMC는 받는 사람 MC-결핍 마우스와 동일한 유전 배경의 골수 세포에서 생성되어야 합니다. 남성 유래 기증자 BMCMC는 여성 마우스의 이식에 적합하지 ?…

Representative Results

‘마스트 세포노크-인’접근법의 개요는 도 1에도시되며, BMCmC의 생성, i.p., 즉 mc-결핍 마우스로 이식해야 하는 세포의 수(실험 설계에 따라 표시될 경우 숫자가 달라질 수 있음) 및 주사 부위에 따라 이식 및 실험 사이의 간격을 포함할 수 있습니다(이 에 따라 달라질 수 있습니다.) 예를 들어,MC 세포질 과립에 저장된 중재자의 함량은38시에꾸준히 증가한다.) 도…

Discussion

초기 설명 38 년 후 거의30년,‘돛대 세포 노크 -in’접근 방식은 MC가 할 수있는 일또는 생체 내에서 할 수없는 일에 대한 귀중한 정보를 계속 제공하고 있습니다. MC의 기능은 오랫동안 알레르기에 있는 그들의 역할에 국한된 것으로 생각되었습니다. ‘마스트 셀 노크-인’접근법을 이용하여 생성된 데이터는 MC가 특정 병원균4,39또는 독28,31에 대한 호스트 방어에 중요…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

N.G.는 프랑스 “퐁디앙 부어 라 레체르체 메디칼 FRM”과 필립 재단의 펠로우십의 수혜자입니다. R.S.는 어린이 건강을 위한 루실 패커드 재단과 스탠포드 NIH/NCRR CTSA 어워드 번호 UL1 RR025744; P.S.는 막스 케이드 재단과 오스트리아 과학 아카데미의 막스 케이드 펠로우십과 오스트리아 과학 기금(FWF) 슈로딩거 펠로우십: J3399-B21의 지원을 받고 있습니다. S.J.G.는 국립 보건원의 지원을 U19 AI104209, NS 080062 및 캘리포니아 대학의 담배 관련 질병 연구 프로그램에서 승인합니다. L.L.R.은 관절염 국립 연구 재단 (ANRF)과 국립 보건 원 보조금 K99AI110645의 지원을 인정합니다.

Materials

1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30G x1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1 % Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03
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Riferimenti

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as ‘tunable’ effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models – Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. ‘Sash’ mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

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Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using ‘Mast Cell Knock-in‘ Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).
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