JoVE Journal > Immunology and Infection
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Immunologia e infezioni

Analysieren der Funktionen von Mastzellen in Vivo mit ' MastCell Knock-in' Mäuse

Published: May 27, 2015
doi:
10.3791/52753
, , , , ,
1Department of Pathology,Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology,Stanford University School of Medicine

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von in vitro abgeleiteten Mastzellen, deren Engraftierung in Mastzell-Mäuse und die Analyse des Phänotyps, der Anzahl und der Verteilung von transplantierten Mastzellen an verschiedenen anatomischen Standorten. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Funktionen von Mastzellen in vivozu bewerten.

Abstract

Mastzellen (MCs) sind hämatopoetische Zellen, die in verschiedenen Geweben leben und besonders häufig an Stellen vorhanden sind, die der äußeren Umgebung ausgesetzt sind, wie Haut, Atemwege und Magen-Darm-Trakt. Am besten bekannt für ihre nachteilige Rolle bei IgE-abhängigen allergischen Reaktionen, MCs haben sich auch als wichtige Akteure in der Wirtsabwehr gegen Gift und eindringende Bakterien und Parasiten. MC-Phänotyp und -funktion können durch Mikroumweltfaktoren beeinflusst werden, die je nach anatomischer Position und/oder je nach Art oder Entwicklungsstadium der Immunantworten abweichen können. Aus diesem Grund haben wir und andere In-vivo-Ansätze gegenüber In-vitro-Methoden bevorzugt, um Einblicke in MC-Funktionen zu gewinnen. Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von mausknochenknochenförmigen kultivierten MCs (BMCMCs), deren Adoptivübertragung in genetisch MC-defizitierte Mäuse und die Analyse der Anzahl und Verteilung von adoptiert übertragenen MCs an verschiedenen anatomischen Standorten. Diese Methode, die als“Mastzellen-Knock-in”-Ansatz bezeichnet wird, wurde in den letzten 30 Jahren ausgiebig eingesetzt, um die Funktionen von MCs und MC-abgeleiteten Produkten in vivozu bewerten. Wir diskutieren die Vorteile und Grenzen dieser Methode im Lichte alternativer Ansätze, die in den letzten Jahren entwickelt wurden.

Introduction

Mastzellen (MCs) sind hämatopoetische Zellen, die aus pluripotenten Knochenmarkvorläufern1-3entstehen. Nach der Knochenmarkegression wandern MCs-Vorläufer in verschiedene Gewebe, wo sie sich unter dem Einfluss lokaler Wachstumsfaktoren1-3zu reifen MCs entwickeln. Geweberesidente MCs befinden sich strategisch an Host-Umgebungsschnittstellen, wie der Haut, den Atemwegen und dem Magen-Darm-Trakt, wo sie sich als erste Verteidigungslinie gegen äußere Beleidigungen3-6verhalten. MCs werden häufig auf der Grundlage ihrer “basiskandigen” phänotypischen Eigenschaften und ihrer anatomischen Positionen unterklassifiziert. Bei Mäusen wurden zwei Arten von MCs beschrieben: “Connective Tissue Type” MCs (CTMCs) und Mucosal MCs (MMCs)1-3,7,8. CTMCs befinden sich oft um Venules und in der Nähe von Nervenfasern und befinden sich in serosalen Hohlräumen, während MMCs intraepitheliale Stellen im Darm und der Atemschleimhaut1-3einnehmen.

Zahlreiche Methoden wurden angewandt, um biologische Funktionen von MCs9-13zu untersuchen. Viele Gruppen haben sich auf In-vitro-Ansätze konzentriert, die entweder Zelllinien (wie die menschlichen MC-Linien HMC114 oder LAD215,16), in vitro abgeleitete MCs (wie humane periphere, blutabgeleitete MCs17oder Mausknochenmark-abgeleitete Kultur) verwenden. d MCs [BMCMCs]18, fetale hautabgeleitete kultivierte MCs [FSCMCs]19 und peritoneale zellabgeleitete MCs [PCMCs]20) oder ex vivo isolierte MCs von verschiedenen anatomischen Standorten. Alle diese Modelle sind weit verbreitet, um molekulare Details der MC-Biologie zu studieren, wie Signalwege, die an der MC-Aktivierung beteiligt sind. Ein wichtiger Aspekt der MCs-Biologie ist jedoch, dass ihre phänotischen und funktionellen Eigenschaften(z. B.zytoplasmatische Granulatproteasegehalt oder Reaktion auf verschiedene Reize) durch anatomische Lage und Mikroumgebung moduliert werden können2,7. Da die genaue Mischung solcher Faktoren, die in vivo auftreten, schwierig sein kann, sich in vitrozu reproduzieren, bevorzugen wir die Verwendung von In-vivo-Ansätzen, um Einblicke in mCs-Funktionen zu gewinnen9.

Es gibt mehrere Mausstämme mit genetischem MC-Mangel, wie die weit verbreiteten WBB6F1–Kit W/W-v oder C57BL/6-Kit W-sh/W-sh Mäuse. Diesen Mäusen fehlt es an Expression und/oder Aktivität von KIT (CD117), dem Rezeptor für den wichtigsten MC-Wachstumsfaktor-Stammzellfaktor (SCF)21,22. Infolgedessen haben diese Mäuse einen tiefen MC-Mangel, haben aber auch zusätzliche phänotypische Anomalien im Zusammenhang mit ihrenc-Kit-Mutationen (in den WBB6F1– Kit W/W-v-Mäusen) oder den Auswirkungen der großen chromosomalen Inversion, die zu einer reduzierten c-Kit-Expression führt (im C57BL/6- Kit W-sh/W-sh-Mäuse) 9,10,12,23 . In jüngerer Zeit wurden mehrere Stämme von Mäusen mit c-Kit-unabhängigem konstitutivem MC-Mangel24-26berichtet. Alle diese Mäuse und einige weitere neue Arten von induzierbaren MC-Mangel Mäuse wurden vor kurzem im Detail überprüft9,10,13.

Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von mausknochenknochenförmigen kultivierten MCs (BMCMCs), deren Adoptivübertragung in MC-mangelhafte Mäuse und die Analyse der Anzahl und Verteilung von adoptiert übertragenen MCs an verschiedenen anatomischen Standorten. Diese sogenannte Mastzell-Knock-in-Methode kann verwendet werden, um die Funktionen von MCs und MC-abgeleiteten Produkten in vivozu bewerten. Wir diskutieren die Vorteile und Grenzen dieser Methode im Lichte alternativer Ansätze, die in den letzten Jahren entwickelt wurden.

Protocol

Alle Tierpflege- und Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und mit der spezifischen Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Stanford University durchgeführt. 1. Erzeugung und Charakterisierung von Knochenmark-abgeleiteten Cultured Mast Cells (BMCMCs). Hinweis: Spender-BMCMCs sollten aus Knochenmarkzellen mit demselben genetischen Hintergrund wie die Empfänger-MC-Mäuse erzeugt werden. Mä…

Representative Results

Eine Übersicht über den Ansatz desMastzell-Knock-insist in Abbildung 1dargestellt und enthält die Erzeugung von BMCMCs, die Anzahl der Zellen, die i.p., i.d. oder i.v. in MC-mäuse einzusiedeln (die Zahl kann variiert werden, wenn sie auf der Grundlage des experimentellen Entwurfs angegeben wird) und das Intervall zwischen Engraftment und Experiment je nach Injektionsstelle (dieses Intervall kann auch variieren, wenn angegeben; z.B.steigt der Gehalt an gespeicherten Mediatoren in MC-…

Discussion

Fast 30 Jahre nach seiner ursprünglichen Beschreibung38, liefert der Ansatz “Mastzellen-Knock-in” weiterhin wertvolle Informationen darüber, was MCs in vivotun können oder nicht tun können. Die Funktionen von MCs galten lange Zeit als auf ihre Rolle bei Allergien beschränkt. Daten, die mit dem “Mastzell-Knock-in“-Ansatz generiert wurden, haben diese Ansicht geändert, indem sie Beweise dafür liefern, dass MCs unter anderem eine entscheidende Rolle bei der Wirtsabwehr gegen best…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

N.G. ist Stipendiat der französischen “Fondation pour la Recherche Médicale FRM” und der Philipp-Stiftung; R.S. wird von der Lucile Packard Foundation for Children es Health und der Stanford NIH/NCRR CTSA Award Nummer UL1 RR025744 unterstützt; P.S. wird unterstützt durch ein Max Kade Fellowship der Max Kade Stiftung und der Österreichischen Akademie der Wissenschaften sowie ein Schroedinger Stipendium des Wissenschaftsfonds (FWF): J3399-B21; S.J.G. unterstützt die Stipendien der National Institutes of Health U19 AI104209, NS 080062 und des Tobacco-Related Disease Research Program an der University of California; L.L.R. unterstützt die Arthritis National Research Foundation (ANRF) und die National Institutes of Health Stipendium K99AI110645.

Materials

1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30G x1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1 % Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03
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Riferimenti

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Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using ‘Mast Cell Knock-in‘ Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).
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