Summary

CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

Published: March 24, 2015
doi:

Summary

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Abstract

傷害に応答して肝臓の炎症は、単球、好中球、T細胞サブセット、B細胞、ナチュラルキラー(NK)およびNKT細胞を含む白血球の異なるサブタイプの浸潤を伴う非常に動的なプロセスである。免疫細胞の遊走を監視するための肝臓の生体内顕微鏡起因試料調製及び固定、光学分割および長期動物の生存に関して高い要件に特に困難である。しかし、炎症過程の動力学ならびに細胞の相互作用の研究は、より良好な炎症性肝疾患の開始、進行および退行を理解するために重要な情報を提供することができる。したがって、高感度で信頼性の高い方法は、集中治療と組み合わせて生体二光子レーザー走査顕微鏡(TPLSM)で長時間(約6時間)マウスの肝臓に移行し、異なる免疫細胞の細胞間相互作用を研究するために設立された監視。

ENT ">提供される方法は、穏やかな調製および器官の最小の摂動と肝臓の安定した固定を含み、長期生体内イメージング最大6時間の期間にわたって事実上退色や光毒性効果を多色多光子顕微鏡を用いて、トラッキングを可能にする特定の白血球サブセットの、及び安定した撮影条件によるマウスの重要なパラメータと循環、温度およびガス交換の安定化の大規模な監視する。

肝臓の炎症の際のリンパ球の遊走を調べるためには、ノックインマウスCXCR6.gfpベースライン条件下および四塩化炭素(CCl 4)の腹腔内注射(複数可)によって誘発される急性および慢性肝障害の後に生体内肝臓イメージングに供した。

、ナチュラルキラー(NK) – – このようなCD4 T細胞などのTリンパ球のサブセットでなく、粘膜associ CXCR6、主にナチュラルキラーT(NKT)上で、リンパ球上に発現されるケモカイン受容体であるatedの不変(MAIT)T細胞1。 CXCR6.gfp +免疫細胞の回遊パターンと位置決め後の肝臓損傷の際、変更された行動を詳細に洞察力、したがって、疾患の進行におけるそれらの潜在的な関与を許可。

Introduction

細胞や器官全体での細胞機能、さらには生物全体の可視化は、本体2の事実上すべての部分を含め、50年以上のために大きな関心となっている。そのため、いくつかの初期の研究では、すでに肝臓3,4の生体内イメージングを採用。しかし、いくつかの制限が肝組織の長期安定した高解像度画像に関する最新に存在する。

によるダイアフラムおよび胃腸管5との密着肝臓の解剖学的位置に、微細な生体イメージングのための最も一般的な問題は、呼吸による動きと、より少ない程度に、腸管の蠕動6である。他の固形臓器と比較して、肝臓手術は特に困難である。による緻密な微小血管構造のために、外科的処置は、大規模な出血性病変を引き起こす障害微小7、また居住者のiの活性化できそのようなクッパー細胞8としてmmune細胞。したがって、組織の機械的固定は6,9は生体顕微鏡イメージングに干渉する可能性がある他の場所で公開されている。

健康な肝臓では、全血液量の10〜15%は、肝血管系内に存在し、臓器循環の変化( 例えば 、血圧変動の影響を非常に受けやすい臓器をレンダリングする、全体的な心拍出量10の約25%を受け取る)。したがって、過度の組織処理または集中循環により、例えば 、せん断応力、変位、損傷に対する肝臓の血流の途絶は、同様に肝臓の免疫応答に影響を与え、白血球遊走行動における人為的な変更、障害、肝酸素したがってさらに肝臓の損傷につながる臓器保存および動物の全体的な生活時間など。

初期の微視的研究は、生体内エピ蛍光MIに基づいていたcroscopy、そのような光退色および低い浸透深さのようないくつかの技術的な制約は、長期の肝臓イメージング4,11,12のためのこの技術の使用を制限する。この新しい方法は、現実の状況13-15の下に、ほぼすべての臓器においてイメージング研究を実行することが技術的に可能であったように、1990年代の多光子顕微鏡の発展に伴い、フォト漂白または侵入深さの制限は主に、解決された。しかし、肝臓イメージングに対する主残された課題であった:いくつかの時間の16のより長い期間の呼吸運動、肝臓組織の自己蛍光、肝類洞に不変の血流を確保し、特に安定したイメージング。

いくつかの研究は、肝臓17における様々な白血球の機能および移動に対処し、 例えば 、NKT細胞18-20、T細胞21,22、肝臓マクロファージ23,24または好中球25、長期多メートルもののicroscopyイメージングはまだ成功し、さらに難しい既存の損傷に起因する急性または慢性の肝疾患を有する動物におけるタスク及び更なる損傷26に、したがってより高い感受性を確立されていなかった。しかし、リアルタイムで回遊行動と肝臓の白血球の細胞機能を監視することは、肝臓の恒常性と疾患27において、その特定の役割で小説洞察を可能にする。

ケモカイン受容体CXCR6は、ナチュラルキラー(NK)細胞、NKT細胞、およびいくつかのT細胞集団18,28を含むいくつかのリンパ球サブセット上で発現される。マウスでの以前の研究は、CXCR6とその同族リガンドCXCL16が恒常性の間に肝正弦波にNKT細胞のパトロールを制御することができることが示されている。したがって、(CXCR6座に緑色蛍光タンパク質[gfpを]のノックインを運ぶ)CXCR6.gfpマウスの使用は、脳29のような種々の器官でのリンパ球の遊走を調べるために記載されているまた、肝臓18,20は 、炎症時にCXCR6.gfp細胞の浸潤を増加を示す。

この研究で提供される方法では、安定化条件下で長期間にわたりこれらのプロセスに従うことが可能であった。生体多光子ベースの手順は、動物や器官の最小限の摂動と高度に再現性があったイメージングを可能にした。呼吸と循環の開閉制御に続く大規模な監視により、長期的な動物の生存のために最適化。と非常に柔軟で、腎臓や脾臓などの他の実質臓器にも採用しやすい。

Protocol

注:実験は、動物の保護に関する(NIH出版、第8版、2011年)「実験動物の管理と使用に関する指針」及び指令63分の2010 / EU以下の動物実験を支配するドイツの法律に従って行った科学的な目的(欧州連合官報、2010)に使用される。公式許可は政府の動物の管理と使用オフィス(LANUVノルトラインヴェストファーレン、レックリングハウゼン、ドイツ)から付与されました。 <p class="jove_content…

Representative Results

私たちの生体内TPLSMアプローチを検証するために、我々は生体内TPLSMイメージングにCXCR6のGFP / +マウスを受ける。マウスは、いずれかのベースライン対照として未処理のまま、または急性肝障害20を誘導するために四塩化炭素(CCl 4)の単回腹腔内注射を行った。 ビデオシーケンスは、2-5時間の期間にわたり採取し、細胞は、それらの緑色蛍光を経…

Discussion

我々の研究の目的は、肝臓の生体TPLSMイメージングのための高度に標準化された安定した再現性のある方法を開発することであった。一般的に、生体内イメージングは​​、開発、恒常性および疾患における異なる白血球集団のホーミングとの相互作用を、以下の実際の生活条件の下で細胞挙動に貴重な洞察を与えている。しかし、呼吸器および腸の蠕動運動を直接他の固形臓器と比較して?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.

Materials

Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20ml Syringe BD Plastipak
250ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25mL Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0,5ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

Riferimenti

  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver–challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -. K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).

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Citazione di questo articolo
Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

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