Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.
The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments, as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier, more quantifiable extracellular relay of signals to the cells.
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.
약물 개발에 대한 현재의 단층 또는 현탁 세포 배양 분석은 사람 세포 미세 환경을 모방하고, 따라서 급속한 탈분화 및 일차 인간 세포 배양 기능의 손실을 초래할 못하고있다. 더 높은 관련성 생리 티슈 모델은 임상 시험으로 시인 전에 화합물의 유효성과 안전성을 예측할 필요가있다. 최근 생체 외 세포 배양 기술의 표준 생체 내 미세 조직을 모방하는 것을 목표로, 입체 모델 다세포 향해 이차원 단층 배양에서 진화 해왔다. 이러한 시스템은 이미 1,2- 화합물의 작용 모드의보다 정확한 예측을 향해 크게 개선을 보여 주었다. 또한, 셀들의 요구에 고도로 전문화 된 시험 관내 배양 조건에 적응하는 것은 특히 중요하다.
시험관 조건에서 표준, 중요한 막 다른 다양한종종 세포에 작용하는 이러한 영양소 및 산소 공급, 축적 제품의 제거, 및 기계적 힘 등 스트럭처 파라미터들은 대부분의 경우에 충분히 제어 할 수 없다. 많은 기관은 물질과 용존 산소의 생리 학적으로 관련 농도 구배를 가지고있다. 그러나, 이러한 엄격한 규제 및 최적화 조건은 매우 불안정한 환경에 선도적 및 세포 개발 (3) 제한, 체외 조건에서 조직 주변의 통제 확산 그라디언트 분명 반대에 있습니다. 따라서, 꾸준하고 시험관 조건에서 특히 더 정량화는 장시간에 걸쳐 생존 및 분화 세포를 보관해야합니다. 배지 성분을 제거하고, 정기적으로 치환되고 관류하는 시스템은 종종 조직의 직접적인 주변 관한 정적 배양보다 제어 가능한 것이 특징이다. 정적 조건, 셀 분비물 확산 그라디언트 및 배양 배지에서 영양소배양 된 세포 3을 둘러싸고 있습니다. 조직 주변 등장 잘 특성화 매체 유속 세포 분비물 관류 통해 풍부한 매질과 혼합 할 수있다. 이것은 안정한 세포 표현형을 보장하고 전체 시험 기간에 걸쳐 4 효소 발현 대사, 세포 미세 환경 규정의 생성을 가능하게한다.
다기관 칩 (MOC)의 최근 발전 시스템 테스트 중에 필요한 물질의 양이 감소로 이어지는 주변 마이크로 바이오 리액터의 작은 매체 균체 요구 조직 공학적 제어 매체 유동의 장점을 결합 기반. 조직 문화에 대한 몇 가지 마이크로 유체 시스템은 지금까지 5,6 설명 하였다. 이러한 시스템 내에서 조직 간 유체 비율은 생리 학적으로 관련 세포의 크로스 토크를 시뮬레이션에 특히 중요한 역할을한다. 그러나, 이러한 외부 펌프 및 미디어 저장소를 사용하는 등 기술적 한계로, 일대부분의 시스템에서 E 전체적인 순환 매체 볼륨은 볼륨 티슈에 비해 너무 크다. 슐러 등.의 그룹은 세포 배양 구획 내 및 생체 조직에 관련된 유체 비율의 7,8에서 물질의 적절한 체류 시간을 보장하는 시스템을 개발했다 제. 이것은 또한 "다른 조직"구획을 나타내는, 96 웰 플레이트에 아래 외부 저장조를 스케일링함으로써 달성되었다. 우리 MOC 플랫폼 내 순환 매체 볼륨을 최소화하기 위해, 우리는 외부 미디어 회로에 대한 필요성을 제거 연동 온칩 마이크로 통합. 이것은 마이크로 미디어 유량 속도 및 전단 응력 비율 (9)의 선택 가능한 개수에서 시스템을 작동 할 수있다. 500 μm의 폭 및 높이 100 ㎛의 마이크로 유체 시스템은 각각이 96 웰 플레이트의 한 웰의 크기를 갖는 두 개의 표준 조직 배양 공간을 상호 접속. 업계 표준 잘 플레이트의 크기 준수S는 트랜스 웰 형식으로 생성 기존 조직 모델의 통합을 허용한다. 또한, 트랜스 웰 세포 배양 삽입물의 수직 위치에만 직접적인 유체 흐름에 노출되지 조직 모델의 재배를 가능하게 조정 가능하지만, 또한 올려 기본 전류로부터 보호 될 수있다. 유사하게, 공기 – 액체 계면이 배양 시스템을 이용 가능하다.
MOC 플랫폼은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 층 2mm 높은 영구적 액밀 미세 유체 회로를 형성하기 위해 저압 플라즈마 산화에 의해 접합 75 X 25mm (2)의 풋 프린트와 유리 현미경 슬라이드 제조된다. 각 채널 및 세포 배양 물을 함유하는 구획 PDMS 층은 표준 소프트 리소그래피 및 복제본 9 성형함으로써 제조된다. 이 연구 기간 동안 사용되는 MOC의 마이크로 유체 설계는 각 두 개의 셀 (C)을 들고, 칩 당 두 개의 분리 된 미세 유체 회로 구성100 ㎛ 높은 채널 시스템에 의해 상호 구획 ulture. 이것은 하나의 다기관 칩을 사용하여 두 개의 개별 티슈 – 공 배양의 성능을 허용했다. 펌핑 주파수는 40 μL / 분의 중간 유량을 수득하도록 조절 하였다.
이러한 2 티슈 MOC 디자인은 생리적 조건 하에서 유동 매체 결합 회로이라도 별도 배양 공간에 간 타원체 및 피부 생검 펀치를 공동 배양하는 기능을 제공했다. 균질 스페 로이드를 형성하도록 1 : 차별화 HepaRG 셀 (24)의 비율로 인간 간 성상 세포 (HHSteC)과 함께 응집시켰다. 비록, 간세포의 약 두 배는 생체 내 상황에 비해 사용 된 이전의 실험에서 관찰 된 바와 같이 열이 비율은 최적 인 것으로 밝혀졌다. 따라서 피부 국소 약물 노출을 가능 트랜스 웰 세포 배양 인서트 내부 공기 – 액체 계면에서 재배 하였다. 이러한 조직 모델은 28 일 동안 cocultivated했다MOC에 AYS는이 시스템의 포괄 성을 입증한다. 또한, 미세 유체 칩의 채널 회로는 충분히 더 밀접 혈관 시스템을 시뮬레이션하기 위해 인간 진피 미세 혈관 내피 세포 (HDMEC)으로 덮여 있었다.
여기에 설명 된 MOC 플랫폼은 장기간의 배양 기간 10,16 통해 동적 매체 흐름 조건에서 다양한 기원의 조직을 배양하기위한 안정적이고 강력한 도구를 나타냅니다. 이 예에서, 플랫폼은 일차 세포 (HDMEC) 세포주로부터 생성 된 조직 당량 (간 응집) 및 조직 생검 상술의 공 배양을 배양하는 데 사용 하였다. MOC는 결합 된 매체 회로에서 28 일 동안 세 조직의 공동 배양을 지속 할 수 있었다. 저자가 아는 한, 생검은, 일차 전지 및 세포주를 포함하는 여러 조직의 공동 배양 네 주 동안 수행 된 처음이다.
마이크로 유체 시스템의 주요 단점 중 하나는 유체 회로의 표면에 접착 재료 작은 분자의 친화이다. 체적비 표면 미세 유체 시스템에서 특히 높을 것으로,이 효과는 더욱 두드러진다 17 </s>까지. 여기에서 소개 채널들의 안정한 HDMEC 커버리지는, MOC 분자로의 부착을 방지하는 장벽으로 작용 생물학적 것이다. 또한, 혈액 응고를 방지 전혈 순환 hemocompatible 용기로서 기능 할 수있다. 장기 당량 전체 혈관 아직 달성되지 않은 그러나 매체 교체 전혈의 사용은 불가능하다. 체외 -generated 조직의 혈관에 작업을 존재하는 유망 및 추가 연구 (18, 19)의 길을 안내합니다.
이것은 간세포 체외 정적 이차원 배양 조건 하에서 20 시간에 걸쳐 간 – 특정 기능을 상실하는 경향이 잘 알려져있다. 특정한 약물의 대사 연구 될 경우 그러한 사이토 크롬 P450 군 대사 효소 등은, 특별한 중요하다. 시토크롬 P450 3A4, 많은 생체 이물질의 생물 전환에 관련된 효소 인 사이토 크롬 P450에 7A, wHICH 14 일 동안 간에서 발현되었다, 담즙산 합성에 MOC에서 배양 응집체 참여하고있다. 이 약물 대사 연구를 허용, 대사 활성 표현형의 보존을 나타냅니다. 정적 배양에 비해 MOC 응집체 증가 알부민 생산 속도는 적절한 배양 조건에 대한 추가의 표시이다. (23) 그러나,이 값 차 인간 간세포 배양 물 (24)들에 도달하지 않았다 – 본 연구 동안 관찰 알부민 생산 속도가 21 인 HepG2 세포를 포함한 미세 유체 칩에 의해 얻어진 이전에보고 된 값보다 비슷하거나 심지어 더 높았다. 또한, MOC 시스템은 임시 레이아웃, 담즙의 별도의 분리를 허용하지 않습니다. MRP-2 염색에 의해 도시 된 바와 같이 편광 된 골재 형성된 담즙 누소관 같은 구조의 셀. 그러나, 그 누소관은 담즙을 수집 기술 채널에 연결되지 않았다. 이러한 비 생리적 믹스혈액 구획 담즙의 보내고하면 시스템의 미래를 재 설계에서 해결되어야한다.
흐름 특성의 조정은 특히 간암과 같은 전단 응력 민감한 조직에 대하여, 중요도가 높은 25이다. 조직에 의해인지 전단 응력의 양은 두 가지 방법으로 변형 될 수있다 : 첫째로, 펌프의 세포막을 내리면 사용 공기압이 저하 될 수 있고, 시스템에서 최대 전단 응력 값을 감소시킨다. 둘째, 조직은 세포 외 매트릭스에 매립 또는 레이어드 트랜스 웰 배양 인서트에서 배양 될 수있다. 후자는 다공성 막과 전류로부터 하부 조직을 보호. 이러한 조정 MOC 실험을 시작하기 전에 각 장기 등가물 개별적으로 수행 될 필요가있다. 144 비트의 높은, 여전히 생리학, 심장 활동에 대응하는 예컨대 2.4 Hz의 맥동 동작, / 분은 인간에서, 전단 응력 측정미세 혈관 회로의 채널은 약 25 DYN / ㎠에 이른다. 이는 채널을 포함한 내피 세포 실험에 따라서, 미세 혈관에서 잘 적용 규모의 높은 단부에서 생리적 전단 응력에 대응하고있다. 제시된 MOC 시스템의 현재의 마이크로 유체 레이아웃 두 기관 구획을 연결하는 한 개의 매체 회로로 구성하지만, 하나의 펌핑 속도 및 전단 응력 비율은 전체 시스템을 위해 선택되어야한다. 따라서, 각각의 단일 기관의 요구 유량 특성의 정확한 조정이 항상 가능하지 않다.
또한, 치료는 일반 배지에 세포를 조정에주의가 필요하다. 시험 관내 세포 배양 물에 대한 표준이기 때문에 전지가 결합 된 미디어 회로 MOC에서 재배되고, 따라서, 각각의 세포 배양 배지는, 각 조직 모델에 사용될 수 없다. 최소 결합 된 미디어 제제는 미리와 t 정의 될 필요가그 셀이 새로운 미디어를 단계적으로 조정되어야한다. 이틀 동안 새로운 미디어 구 80 % / 20 %의 조절 절차는 다음, 50 % / 50 % 20 % / 80 %이어서, 그리고 전체 교환은 항상 손에 문화의 적절한 세포 생존 및 기능되었다.
MOC 시스템의 현재 미세 유체 레이아웃은 최대 세 조직의 공동 배양 할 수 있습니다. 인체의 적어도 10 개의 가장 중요한 장기의 공 배양은 항상성에 도달하는데 필요하다. 따라서, 표시 시스템은 특정 조직 – 조직 상호 작용 아니지만 물질 진정한 전신적 반응을 예측할 수있다. 더 장기 충치를 포함하는 MOC의 발전이 예상된다. 또한, 시스템의 유효성은 기준 화합물의 세트를 사용하여 도시한다. 바람직하게는, (예 : 트로글리타존) 임상 시험 동안 실패 화합물은 MOC에서의 성능 시험을하여야한다. 반면, 복잡한 시스템의 진정한 검증은 여전히 b를 방해한다Y 이것과 유사한 시스템의 성능에 대한 독성 학적 데이터 수집 기능 평가를위한 바이오 마커 및 끝점에 관한 표준화의 부족, 신뢰성 및 응용 분야를 확장 할 것이다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 GO-바이오 부여 번호 0315569을, 교육 및 연구를위한 독일 연방 정부에 의해 자금을 지원하고있다.
Name of Material/ Equipment | Company | Comments/Description | |
HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate | |
HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
Trypsin/EDTA | Biowest | ||
Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25mm | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |