Summary

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em> Neoformans קריפטוקוקוס</em

Published: December 19, 2014
doi:

Summary

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Abstract

Cryptococcosis הוא זיהום מסכן חיים הנגרם על ידי פטריות פתוגניים של הסוג קריפטוקוקוס. זיהום מתרחש על שאיפה של נבגים, אשר מסוגלים לשכפל בריאה העמוקה. Phagocytosis של קריפטוקוקוס על ידי מקרופאגים הוא אחת הדרכים שהמחלה יכולה להתפשט למערכת העצבים המרכזית לגרום meningoencephalitis הקטלני. לכן, מחקר של הקשר בין קריפטוקוקוס ומקרופגים הוא חשוב להבנת ההתפתחות של הזיהום. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול צעד-אחר-צעד כדי ללמוד infectivity מקרופאג ידי ג neoformans במבחנה. השימוש בפרוטוקול זה, התפקיד של סטרולים מארח על אינטראקציות מארח הפתוגן הוא למד. ריכוזים שונים של מתיל – cyclodextrin (MCD) שמשו לרוקן את הכולסטרול מJ774A.1 שורת תאים העכברי סרקומה הרשתית כמו מקרופאג. כולסטרול הדלדול אושר ולכמת באמצעות שני מסחרי availablערכת דואר כימות כולסטרול וכרומטוגרפיה בשכבה דקה. תאי כולסטרול מדולדל הופעלו באמצעות Lipopolysacharide (LPS) ואינטרפרון גאמא (IFNγ) ונגועים בneoformans קריפטוקוקוס-opsonized נוגדן תאי H99 wild-type ביחס מפעיל ליעד של 1: 1. תאים נגועים היו במעקב אחרי 2 שעות של דגירה עם ג neoformans ומדד phagocytic חושב. כולסטרול דלדול הביא לירידה משמעותית במדד phagocytic. הפרוטוקולים שהוצגו מציעים שיטה נוחה לחקות את תחילת תהליך הזיהום בסביבת מעבדה וללמוד את התפקיד של הרכב שומנים מארח על infectivity.

Introduction

Phagocytosis הוא תהליך שבו גופים תאיים מופנמים על ידי תאי מארח. זהו נשק מרכזי בארסנל של מערכת החיסון להגן מפני פתוגנים, אך התהליך עשוי לעתים קרובות להיות חתר תחת ידי פתוגנים כדי לאפשר להפנמה ולהתפשט בכל הגוף 1. Phagocytosis מתווך על ידי מספר אירועי איתות שיביאו להתקשרות ובליעה באמצעות ארגון מחדש של שלד התא של התא המארח. phagocytes 'המקצועית' מסוגל לזהות ולהיקשר לopsonins על פני השטח של הפולש לאותת להתקשרות והיווצרות lamellipodia, אשר לבלוע את הפתוגן ויוצר phagosome 2. בין phagocytes "המקצועי" שנקרא מקרופאגים. המקרופאגים הם תאים מאוד מיוחדים שיבצעו את התפקידים הגנתיים הכוללים לחפש וביטול גורמי מחלה גורמת, תיקון רקמות שנפגעו, ומתווך דלקת, רובאלה בתהליך של phagocytosis 1,2.

neoformans קריפטוקוקוס הוא מינים של שמרים פתוגניים שגורם למחלה קשה הידועה בשם Cryptococcosis. נבגי קריפטוקוקוס הם נשאפים על ידי המארח ולגרום לדלקת ריאות שהיא בדרך כלל ללא תסמינים. הוא חשב כי החשיפה היא מאוד נפוצה; מדגם של 61 ילדים ממחל זיהומיות בילדי קליניקה במרכז בית החולים בברונקס-לבנון מצאה כי כל שהשתתפו בסקר היו אלה נוגדנים לglucuronoxylomannan פוליסכריד cryptococcal ומחקרים אחרים הראה שכיחות בשני וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגוע ומבוגרים נגועים 3, 4. מקרופאגים מכתשיים הם הקו הראשון של תגובה לדלקת ריאות וברוב המקרים בהצלחה ברור הפתוגן. עם זאת, אצל אנשים מדוכאי חיסון (חולים למשל, HIV ואיידס) השמרים הוא מסוגלים לשרוד בתוך מקרופאגים. באלהמקרים, מקרופאגים יכולים לשמש כנישה לשכפול של הפתוגן ועשויים להקל על הפצתו למערכת העצבים המרכזית (CNS) שבו המחלה הופכת קטלנית 5-8. הוא חשב כי מקרופאגים אולי אפילו לספק את השמרים ישירות לתוך קרומי המוח, עוזרים השמרים לחצות את מחסום דם המוח באמצעות המודל "סוס טרויאני" 3,9 – 11. לפיכך, חשוב להבין את התהליך של phagocytosis וגורמים המשפיעים עליו, בעיקר בזיהומי cryptococcal.

העבודה קודמת במערכות פתוגן אחרות מצביעה על רפסודות כולסטרול ושומנים בדם נוצרות על ידי כולסטרול כבעל תפקיד חשוב בphagocytosis 12 – 15. כולסטרול הוא מיני שומנים הנפוצים ביותר בתאי יונקים וכולל 25-50% מקרום התא היונקים 16. זה כבר נמצא לשחק תפקיד בויסות הביופסיהמאפייני hysical של ממברנות על ידי שינוי קשיחותם 17. כולסטרול וsphingolipids יחד יוצרים microdomains שומנים בתוך הקרום הידוע כרפסודות שומנים בדם. רפסודות שומנים בדם נמצאו להיות מעורבת בהיווצרות caveolae, כמו גם מתן תחום מבודד לסוגים מסוימים של איתות 16-18. בשל גודלם הקטן, שקשה ללמוד רפסודות שומנים בגוף חי. דרך שימושית אחד כדי ללמוד את התפקיד של רפסודות שומנים היא לשנות בוחריהם. מתיל-β-cyclodextrin (MβCD) היא תרכובת שנמצאה לרוקן את הכולסטרול מקרומי יונקים ומשמש בדרך כלל כדי ללמוד את התפקיד של רפסודות שומנים 18.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לרוקן את הכולסטרול מקרום תא מארח ולכמת את ההשפעה של הדלדול ביכולתם של תאי המארח לphagocytose ג neoformans במבחנה. הליך זה עושה שימוש בתרבית תאי techniques על מקרופאג הונצח כמו שורת תאים (J774A.1) כמודל לזיהום. כולסטרול דלדול הושג על ידי חשיפה לMβCD, שבו יש ליבה הידרופובי ספציפית לגודל של סטרולים והוא מסוגל לפעול ככיור לכולסטרול לצייר מתוך הקרום 19. כולסטרול דלדול נמדד כמותית באמצעות ערכה זמינה מסחרי ואיכותי באמצעות שאיבת שומנים בליי-דייר שונה ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) 20. . Phagocytosis נמדד על ידי הדבקה של תא הקו עם תרבות של שמרי opsonized מעורבבים עם קוקטייל של אינטרפרון-γ וlipopolysaccharide להפעלת מקרופאגים קריפטוקוקוס היה opsonized באמצעות נוגדן glucuronoxylomannan (GXM) 21 – 23. מכתים וניסויים במיקרוסקופ אפשרו להדמיה של התאים וחישוב מדד phagocytic להעריך את מידת הרס עצמי. יחדיו, ד פרוטוקול זהescribes שיטה בסיסית, המשלבת את שינוי הרכב שומנים בדם עם תהליך פיסיולוגי.

Protocol

1. כולסטרול דלדול של תאי J774A.1 עם MβCD בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, תאים כמו מקרופאג-10 5 J774A.1 זרע לכל גם על צלחת תרבית תאי 96-גם ב -200 μl של הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין …

Representative Results

כולסטרול דלדול ניתוח של supernatant שמורות בשלב 1.3 של הפרוטוקול על ידי ביצוע הוראות היצרן בערכת הכולסטרול Assay Amplex האדומה מניב ריכוז גבוה של כולסטרול במדגם MβCD טופל בהשוואה לשליטת 1x PBS. בהתאם לסוג תא ודלדול כולסטרול ריכוז MβCD משמש עשוי להש?…

Discussion

בעבודה עם פרוטוקול זה חשוב להשיג ספירת תאים מדויקת כאשר ציפוי תאי יונקים וopsonizing ג תאי neoformans. זה ממזער וריאציה בין ניסויים ומבטיח 1 מדויק: יעד 1 יחס מפעיל לאורך כל תקופת המחקר. זה גם קריטי כדי לתאם את התזמון של דלדול הכולסטרול וזיהום כדי למנוע את תאי שמרי opsonized ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH AI56168, AI71142, AI87541 וAI100631 לMDP. מאוריציו Del Poeta הוא בורוז Wellcome חוקר במחלות זיהומיות.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Class II type A2 Biosafety Cabinet Labconco 3460009
J774A.1 cell line ATCC TIB-67 Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus Gibco 10082-147 Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122 Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator Fisher Scientific Model # 3530
96-Well culture dish Corning Inc. Costar 3595
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BioReagents BP3994 Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-Cyclodextrin Sigma Life Science C4555-10G Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations
Orbital Shaker Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Life Technologies Molecular Probes A12216 All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate Corning Inc. Costar 3603
FilterMax microplate reader Molecular Devices Model F5
TLC Chamber Sigma-Aldrich Z126195-1EA
Chloroform Sigma-Aldrich 650498-4L
Methanol Sigma-Aldrich 34860-2L-R
TLC Paper Whatman 3030917 Cut down to size needed for TLC tank
Fume Hood Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards 
6-Well Plate Corning Inc. Costar 3506
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Cell Scraper Corning Inc. Costar 3010
Hemocytometer  Hausser Scientific 1490
Centrifuge Beckman Coulter Model Alegra x-30R
Votex Mixer Fisher Scientific 12-812
Balance Mettler Toledo Model # MS104S Meaures down to .1 mg
Glass Pasteur Pipette Fisherbrand 13-678-20A
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700000
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific Model # SPD2010 
Petroleum Ether Fisher Scientific E139-1 
Diethyl Ether Sigma-Aldrich 309966 
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone Analytical Chromatograhy Millipore 1.11845.0001
Iodine Chips Sigma-Aldrich 376558-50G
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 320501 
Manganese Chloride Sigma-Aldrich 244589
UVP EC3 Imaging System Ultra-Violet Products Ltd. Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass Bottom Confocal Dish MatTek P35G-1.5-10C www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99) Obtained from Duke University Medical Center
YNB BD 239210 See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide Sigma L4391-1MG Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma Sigma I4777 Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL
Giemsa MP Biomedicals 194591 Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope Zeiss Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images

Riferimenti

  1. Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
  2. Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
  3. Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173 (2012).
  4. Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
  5. Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
  6. Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
  7. Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
  8. Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
  9. Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
  10. García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
  11. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
  12. Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, 415-423 (2003).
  13. Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
  14. Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
  15. Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
  16. Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
  17. Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
  18. Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
  19. Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
  20. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  21. Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
  22. Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
  23. Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).
  24. Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).

Play Video

Citazione di questo articolo
Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (94), e52432, doi:10.3791/52432 (2014).

View Video