Summary

الحث المباشر من العصبية الإنسان الخلايا الجذعية من خلايا الدم المحيطي المكونة للدم السلف

Published: January 28, 2015
doi:

Summary

وقد تم تطوير طريقة لاستخلاص مباشرة الخلايا الجذعية العصبية البشرية من الخلايا الاصلية المكونة للدم التخصيب من خلايا الدم الطرفية.

Abstract

الأمراض التي تصيب البشر الثقافات العصبية محددة ضرورية لتوليد نماذج في المختبر للأمراض العصبية البشرية. ومع ذلك، فإن عدم الوصول إلى الكبار البشري الثقافات العصبية الأولية يثير تحديات فريدة من نوعها. التطورات الأخيرة في الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (IPSC) توفر نهجا بديلا لاستخلاص الثقافات العصبية من الخلايا الليفية الجلد من خلال المريض IPSC محددة، ولكن هذه العملية كثيفة العمالة، ويتطلب خبرة خاصة وكميات كبيرة من الموارد، ويمكن أن يستغرق عدة أشهر. هذا يمنع تطبيق واسع لهذه التكنولوجيا لدراسة الأمراض العصبية. للتغلب على بعض من هذه القضايا، وقد وضعنا طريقة لاستخلاص الخلايا الجذعية العصبية مباشرة من الكبار البشري الدم المحيطي، وتجاوز عملية الاشتقاق IPSC. كانت الخلايا الاصلية المكونة للدم المخصب من الكبار البشري الدم المحيطي المستزرعة في المختبر، وtransfected مع ناقلات فيروس سينداي التي تحتوي على عوامل النسخي Sox2 أكتوبر3/4، Klf4، وج. Myc على. نتائج ترنسفكأيشن في تغيرات شكلية في الخلايا التي يتم اختيارها مزيد باستخدام البشري المتوسطة السلف العصبية التي تحتوي على عامل أساسي نمو الخلايا الليفية (bFGF) وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF). وتتميز الخلايا الناجم عن ذلك التعبير عن علامات الخلايا الجذعية العصبية، مثل nestin وSOX2. هذه الخلايا الجذعية العصبية يمكن أن تكون متباينة أيضا على الخلايا العصبية، دبق نجمي الخلايا و oligodendrocytes في وسائل الإعلام التمايز محدد. يمكن الوصول إليها بسهولة عن طريق عينات الدم المحيطية الإنسان، يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لاستخلاص الخلايا الجذعية العصبية لمزيد من التمايز للخلايا العصبية في المختبر لنماذج من الاضطرابات العصبية ويمكن أن تقدم الدراسات المتعلقة المرضية وعلاج تلك الأمراض.

Introduction

في المختبر وقد استخدمت الثقافات العصبية كأداة أساسية للدراسات الأمراض العصبية. الحيوان الأساسي (ومعظمهم من القوارض) الثقافات العصبية 1 و 2 و خطوط الخلايا العصبية البشرية المستمدة من الاورام الدبقية أو الأورام الأخرى هي الأكثر استخداما في مثل هذه الدراسات. ومع ذلك، فقد تم الاعتراف بأن هناك اختلافات كبيرة بين القوارض والخلايا البشرية. لا يمكن أن تترجم العديد من النتائج على أساس القوارض للإنسان. وعلاوة على ذلك، مع التطورات السريعة في تحليل المعلومات الجينومية الجماعية والتحرير الجين السهل نسبيا وكله تسلسل الجينوم، فإن الاتجاه هو المزيد والمزيد من استعداداتها لاكتشاف المرض الجينات معرضة وترسيم وظائفهم وأدوارهم في أمراض معينة، مما يجعل الخلايا العصبية البشرية قليلة وقد خطوط الخلايا استخدام تقتصر فقط. من الناحية النظرية، والثقافات العصبية الأولية الإنسان المستمدة من عينات من الجهاز العصبي المريض هي أفضل خيار إلا أنه من المستحيل للحصول عليها. ميث بالتالي البديلالمواد المستنفدة للأوزون ضرورية. في السنوات الأخيرة، تم ملاحقة بعض المناهج، مع اثنين من كونها الأكثر تمييزها. بعد تطوير هذه التقنية لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (IPSC) باستخدام الماوس والخلايا الجسدية الإنسان 3، 4، والخلايا العصبية يمكن أن يكون أبعد متباينة منها 5-7. ومع ذلك، وتوليد وتوصيف IPSC يطالب كثيفة العمالة، والتقنيات، والمدخلات الوقت، وأحيانا حتى باهظة. بعد فترة وجيزة، تم تطوير نهج آخر لتحويل الخلايا العصبية مباشرة من الخلايا الجسدية 8، 9. وبما أن الخلايا العصبية الناتجة غير التكاثري، فإنه يحد تطبيقه في الدراسات المكثفة وفحص المخدرات، الأمر الذي يتطلب كمية كبيرة من الخلايا. للاستفادة من التقنيات على حد سواء، الاشتقاق المباشر للالجذعية العصبية / الخلايا الاصلية من الخلايا الجسدية تم استكشافها من قبل عدة مجموعات 10-12، التي تتجاوز عملية شاقة من الجيل IPSC وتوصيف ولكن لا يزال. نحن نتعاملقصر عدد محترم من الخلايا الجذعية العصبية للتمايز العصبي لاحق. لقد أظهرنا سابقا أنه بعد إدخال عوامل النسخ ياماناكا في الخلايا الاصلية المكونة للدم والخلايا الجذعية العصبية يمكن أن تتولد مباشرة باستخدام خلية العصبية السلف اختيار المتوسطة 13. هنا، ونحن التقرير الطريقة بالتفصيل.

Protocol

1. إثراء المكونة للدم السلف خلايا من الدم الكامل الكبار ملاحظة: السلف المكونة للدم الخلايا أو CD34 + الخلايا يمكن تنقيته من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) المستمدة من مجموعة متنوعة من المصادر بما في ذلك دم الحبل السري، المواد ف…

Representative Results

نوعية خلايا CD34 أمر بالغ الأهمية لنجاح العصبي التنبيغ الخلايا الجذعية. خلايا CD34 جودة عالية تتكاثر خلال أول يومين من الثقافة ويبدو أنها غير ملتصقة، وخلايا مستديرة متجانس، وتطفو فوق الجزء السفلي من السفن الثقافة (الشكل 1A). نتائج العدوى الناجحة في المجاميع خ…

Discussion

ويرد بروتوكول مفصلة لتوليد مباشرة الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا الاصلية المكونة للدم الطرفية.

مقارنة مع الخلايا الليفية، الدم المحيطي البشري هو أكثر سهولة. باستخدام بروتوكول المقدمة، أكثر من 1 × 10 5 الخلايا المكونة لل…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Materials

Material List
Name Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Separation Medium Lonza 17-829E 1 X
SepMate Stemcell Technologies 15415 15 mL
Human Serum Invitrogen 34005-100
Antibiotics Gibco 15240-062 1%
CD34 MultiSort Kit Miltenyi Biotec 130-056-701
EDTA Cellgro 46-034-Cl  2mM
MACS LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
StemSpan SFEM Medium Stemcell Technologies 9650 1X
IMDM Quality Biologicals 112-035-101 1X
TPO Peprotech 300-18 100 ng/mL
Flt-3 Peprotech 300-19 100 ng/mL
SCF Peprotech 300-07 100 ng/mL
IL-6 Peprotech 200-06 20 ng/mL
IL-7  Peprotech 200-07 20 ng/mL
IPS Sendai Reprogramming Kit Life technologies A1378001
Cell scraper Sarstedt 83.183
DMSO Sigma D2650
CryoTube vials Thermo 368632
Mr. Frosty container Thermo 5100-0001
DMEM/F12 Life technologies 12400-024 1X
N2 supplement Life technologies 17502-048 1X
Bovine serum albumin Sigma A2934 0.1% (w/v)
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/ml
EGF Peprotech AF-100-15
B27 supplement Life technologies 17504-044 1X
NSC serum free medium Life Technologies A1050901 1X
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips BD Bioscences 354087
cAMP Sigma A9501 300 ng/ml
Vitamin C Sigma A0278 0.2 mM
BDNF Peprotech 450-02 10 ng/ml
GDNF Peprotech 450-10 10 ng/ml
Poly-L-Ornithine Sigma P4957 1X
PDGF-AA Peprotech 100-13A 10 ng/ml
NT-3 Peprotech 450-03 2 ng/ml
Shh Peprotech 1314-SH/CF 2 ng/ml
T3 Sigma T6397 3 nM
PFA Sigma P6148 4%
PBS Quality Biological 119-069-101 1X
Goat serum Sigma G9023 4%
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal anti-Nestin Millipore AB5922 1:1000 dilution
Anti-SOX2  antibody Applied Stemcell ASA0120 Ready to use
Mouse anti-βIII-tubulin antibody Promega G712A 1:1000 dilution
Rabbit anti-GFAP antibody Sigma G4546 1:100 dilution
Anti-O4 antibody R&D Systems MAB1326 IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody Life techniologies A11012 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody Life techniologies A11001 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Life techniologies A21042 1:250 dilution
DAPI Sigma D9542 1 ug/ml

Riferimenti

  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington’s Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
  8. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  9. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
  10. Lee, S. -. T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
  11. Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  12. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
  13. Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
  14. Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
  15. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
  16. Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).

Play Video

Citazione di questo articolo
Wang, T., Choi, E., Monaco, M. C. G., Major, E. O., Medynets, M., Nath, A. Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (95), e52298, doi:10.3791/52298 (2015).

View Video