Summary

Прямая индукция человеческих нервных стволовых клеток из периферической крови гемопоэтических клеток-предшественников

Published: January 28, 2015
doi:

Summary

Способ был разработан, чтобы непосредственно получить человека нервные стволовые клетки из гемопоэтических клеток-предшественников, обогащенных из клеток периферической крови.

Abstract

Человек по конкретным заболеваниям нейронные культуры имеют важное значение для создания в моделях пробирке для неврологических заболеваний человека. Тем не менее, отсутствие доступа к первичной человеческой взрослых нейронных культур вызывает уникальные проблемы. Последние события в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) обеспечивает альтернативный подход для получения нейронных культур из фибробластов кожи через пациента конкретной IPSC, но этот процесс является трудоемким, требует специальных знаний и большого количества ресурсов, и может занять несколько месяцев. Это препятствует широкому применению этой технологии для изучения неврологических заболеваний. Для преодоления некоторых из этих вопросов, мы разработали метод для получения нервные стволовые клетки непосредственно из человеческого взрослых периферической крови, минуя процесс выведения IPSC. Гемопоэтических клеток-предшественников, обогащенные от взрослого человека периферической крови культивировали в пробирке и трансфицировали вирусных векторов, содержащих Сендай факторы транскрипции Sox2, октябрь3/4, Klf4 и C-Myc. Результаты трансфекции в морфологических изменений в клетках, которые в дальнейшем выбранных с помощью человека среда нейронной предшественников, содержащий основной фактор роста фибробластов (bFGF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Полученные клетки характеризуются выражения для нейронных маркеров стволовых клеток, таких как нестина и SOX2. Эти нервные стволовые клетки могут быть в дальнейшем дифференцирована с нейронами, астроглию и олигодендроциты в указанной среде для дифференцировки. Использование легко доступных образцов периферической крови человека, этот способ может быть использован для получения нервные стволовые клетки для дальнейшей дифференциации нервных клеток к для моделирования в пробирке неврологических расстройств и может продвинуть исследования, связанные с патогенезе и лечении этих заболеваний.

Introduction

В пробирке нейронов культуры были использованы в качестве основополагающего инструмента исследований неврологических заболеваний. Первичный животных (в основном грызунов) нейронные культуры 1, 2 и нейронные клеточные линии человека, полученные из глиомы или других опухолей наиболее часто используемый в таких исследованиях. Тем не менее, было признано, что существуют значительные различия между грызунов и клетках человека. Многие выводы, основанные на грызунах не могут быть переведены на людей. Кроме того, с быстрым развитием анализа массы геномной информации и относительно легко редактировать генов и весь секвенирование генома, тенденция становится все более и более ориентированы на обнаружение заболевания, склонные гены и разграничения их функций и роли в конкретных заболеваний, что делает несколько человеческих нейронов клеточные линии ограничивается только использованием. Теоретически, первичные нервные культуры человека, полученные из образцов пациентов нервной системы лучший выбор, но их невозможно получить; следовательно, альтернатива метОРВ необходимо. В последние годы некоторые подходы были использованы, с двумя является наиболее различимы. После развития техники генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с помощью мыши и соматических клеток человека 3, 4, нервные клетки могут быть дополнительно отличается от них 5-7. Тем не менее, генерации и характеризующие IPSC требует интенсивного труда, методы и ввод времени, иногда даже чрезмерно. Вскоре после этого, еще один подход был разработан, чтобы преобразовать непосредственно нервных клеток из соматических клеток 8, 9. Как в результате нейроны непролиферативная, он ограничивает его применение в интенсивных исследований и скрининга лекарственных средств, что требует большого количества клеток. Для того, чтобы преимущества обеих технологий, прямой вывод нервных стволовых клеток / клеток-предшественников из соматических клеток были изучены несколько групп 10-12, который обходит утомительный процесс генерации IPSC и характеристике, но еще предоставледе приличное число нервных стволовых клеток для последующего нервной дифференциации. Ранее мы показали, что после введения транскрипционных факторов Яманака в гемопоэтических клеток-предшественников, нервные стволовые клетки могут быть непосредственно получены с использованием нейронной клетки-предшественника, выбирающий среду 13. Здесь мы сообщаем метод в деталях.

Protocol

1. Обогащение гемопоэтических клеток-предшественников из взрослых цельной крови Примечание: гемопоэтических предшественников клетки или клетки CD34 + могут быть очищены от мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), полученных из различных источников, включая пуп?…

Representative Results

Качество CD34 клеток имеет решающее значение для успеха нервной трансдукции стволовых клеток. Высокое качество CD34 клетки пролиферируют в течение первых двух дней культуры и появляются как не сторонник, равномерно круглых клеток, плавающих чуть выше нижней части сосудов для культиви…

Discussion

Подробный протокол, чтобы непосредственно генерировать нервные стволовые клетки из периферической гемопоэтических клеток-предшественников обеспечивается.

По сравнению с фибробластов, периферической крови человека является более доступным. Использование подарил пр…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Materials

Material List
Name Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Separation Medium Lonza 17-829E 1 X
SepMate Stemcell Technologies 15415 15 mL
Human Serum Invitrogen 34005-100
Antibiotics Gibco 15240-062 1%
CD34 MultiSort Kit Miltenyi Biotec 130-056-701
EDTA Cellgro 46-034-Cl  2mM
MACS LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
StemSpan SFEM Medium Stemcell Technologies 9650 1X
IMDM Quality Biologicals 112-035-101 1X
TPO Peprotech 300-18 100 ng/mL
Flt-3 Peprotech 300-19 100 ng/mL
SCF Peprotech 300-07 100 ng/mL
IL-6 Peprotech 200-06 20 ng/mL
IL-7  Peprotech 200-07 20 ng/mL
IPS Sendai Reprogramming Kit Life technologies A1378001
Cell scraper Sarstedt 83.183
DMSO Sigma D2650
CryoTube vials Thermo 368632
Mr. Frosty container Thermo 5100-0001
DMEM/F12 Life technologies 12400-024 1X
N2 supplement Life technologies 17502-048 1X
Bovine serum albumin Sigma A2934 0.1% (w/v)
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/ml
EGF Peprotech AF-100-15
B27 supplement Life technologies 17504-044 1X
NSC serum free medium Life Technologies A1050901 1X
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips BD Bioscences 354087
cAMP Sigma A9501 300 ng/ml
Vitamin C Sigma A0278 0.2 mM
BDNF Peprotech 450-02 10 ng/ml
GDNF Peprotech 450-10 10 ng/ml
Poly-L-Ornithine Sigma P4957 1X
PDGF-AA Peprotech 100-13A 10 ng/ml
NT-3 Peprotech 450-03 2 ng/ml
Shh Peprotech 1314-SH/CF 2 ng/ml
T3 Sigma T6397 3 nM
PFA Sigma P6148 4%
PBS Quality Biological 119-069-101 1X
Goat serum Sigma G9023 4%
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal anti-Nestin Millipore AB5922 1:1000 dilution
Anti-SOX2  antibody Applied Stemcell ASA0120 Ready to use
Mouse anti-βIII-tubulin antibody Promega G712A 1:1000 dilution
Rabbit anti-GFAP antibody Sigma G4546 1:100 dilution
Anti-O4 antibody R&D Systems MAB1326 IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody Life techniologies A11012 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody Life techniologies A11001 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Life techniologies A21042 1:250 dilution
DAPI Sigma D9542 1 ug/ml

Riferimenti

  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington’s Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
  8. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  9. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
  10. Lee, S. -. T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
  11. Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  12. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
  13. Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
  14. Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
  15. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
  16. Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).

Play Video

Citazione di questo articolo
Wang, T., Choi, E., Monaco, M. C. G., Major, E. O., Medynets, M., Nath, A. Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (95), e52298, doi:10.3791/52298 (2015).

View Video