Нестин-выражения предшественники являются недавно выявленный население нейронных клеток-предшественников в развивающемся мозжечке. Используя технику микродиссекции представленные здесь в сочетании с флуоресцентной активированный сортировки клеток, это популяция клеток может быть очищен и загрязнение от других мозжечка регионах и могут культивироваться для дальнейших исследований.
Микродиссекция является новым методом, который может выделить конкретные регионы ткани и ликвидации загрязнения из клеточных источников в прилегающих районах. Этот метод был впервые использован в исследовании Нестин-экспрессирующих клеток-предшественников (ПОШ), недавно идентифицированный популяция клеток в коре внешнего зародышевого слоя (EGL). Использование микродиссекции в сочетании с флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS), чистый население ПОШ были собраны отдельно от обычных предшественников гранула нейронных в EGL и от других загрязняющих Нестин-экспрессирующих клеток в мозжечке. Без микродиссекции, функциональный анализ ПОШ не было бы возможно с текущими методов, доступных, таких как Перколла градиентного центрифугирования и лазерного захвата микродиссекции. Этот способ также может быть применен для использования с различных тканей, которые содержат либо распознаваемые участки или флуоресцентно-меченых клеток. Самое главное, главное преимущество этой microdissectioТехника п является то, что изолированные клетки живут и могут культивироваться для дальнейших экспериментов, который в настоящее время не представляется возможным с другими описанными методами.
Мозжечок состоит из нескольких слоев клеток, каждый из которых различных типов клеток. Во время разработки, EGL содержит пролиферирующих гранул нейронов прекурсоры (ВНП) в то время как молекулярный слой и Пуркинье слой содержит Bergmann глии и нейронов Пуркинье, соответственно. Глубоко внутри мозжечка лежит белое вещество, которое содержит нервные стволовые клетки (НСК) и олигодендроциты 1.
Еж Соник (Тсс) играет важную роль в регуляции развития мозжечка и, в частности, она способствует распространению ВНП через связывание с его рецептором исправленными (PTC), негативный регулятор Тсс сигнализации 2-4. Ненормальная активация передачи сигналов Shh генерирует медуллобластома (МБ), наиболее распространенной злокачественной опухоли мозга у детей 5,6.
Ptc мутантные MB трансгенные мышиные модели являются мощными инструментами для изучения МБ и развиваться опухоли, напоминающие человеческую МБ 7,8. Используя этимышей, было обнаружено, что ВНП являются клетки происхождения для ежа типа МБ 7. Кроме того, в дополнение к ВНП, недавно мы определили уникальную популяцию нейрональных клеток-предшественников в пределах EGL развивающегося мозжечка, которые также могут повлечь за собой МБ. Эти клетки экспрессируют высокие уровни типа VI промежуточного нитей белка, нестин и называются ПОИ 9. ПОШ находятся в глубоководной части EGL и существуют временно только во время развития неонатальной мозжечка. Они привержены гранула клеточной линии, как ВНП, но различны, поскольку они находятся в состоянии покоя и не выражают Math1, хорошо налаженные маркер для обычных ВНП 10. Кроме того, ПОШ приводят к МБ более эффективно, чем ВНП после активации сигнального пути Тсс 9, что делает их роман происхождения для МБ туморогенеза.
Мы ранее изолированные ПОШ из мозжечка EGL в послеродовой день 4 (P4) по методике микродиссекцииОписанный здесь 9. Микродиссекция через прямого микроскопического визуализации ткани позволяет конкретной рассечения мозжечка EGL. Это необходимо, поскольку Нестин также выражается НСК в белого вещества мозжечка и Bergmann глии в молекулярном слое 1,7,11,12 и это было важно, что эти клетки не могут быть включены, так как они бы посрамить анализ. Клетки, выделенные из ткани микродиссекции можно использовать немедленно для молекулярного анализа или они могут быть выращены в течение дальнейших применений.
Для помощи в специально microdissecting на EGL и для дальнейшей очистки ПОШ, Math1-GFP (зеленый флуоресцентный белок) мышей скрестили с нестин-CFP (голубой флуоресцентный белок) мышей. Транскрипционный фактор Math1 специфически экспрессируется ВНП и выражения GFP отчетливо видна в EGL 9,13. Мышей Нестин-CFP выразить ядерную форму CFP и могут быть легко визуализированы в молекулярном слое 9,14. Вместе, GFP и выражение CFP создать границы для микродиссекции на EGL (рисунок 1). CFP-положительные ПОШ были затем выделяли FACS, после ферментативной диссоциации расчлененных EGLs.
В настоящее время наиболее хорошо использовать метод выделения клеток из EGL является Перколла центрифугирования в градиенте всей мозжечка ткани 15,16. Этот метод, однако, не может полностью исключить клеточных популяций Нестин + от молекулярного слоя и белого вещества, и поэтому не может быть использован для изучения ПОИ. Лазерный микродиссекции захвата, который использует передачу энергии лазера для удаления клеток, представляющих интерес, является еще одним методом, используемым для изоляции специфические клетки в гетерогенной ткани 17,18, но захваченные клетки могут быть использованы только для восстановления ДНК, РНК и белка и не состоянии культивировать.
Этот протокол предоставляет возможность специально изолировать живую, чистую популяцию ПОШ от EGL.Этот способ также может быть применен к различным типам тканей, которые либо узнаваемый анатомической архитектуры или флуоресцентно меченых клеток / регионах. Таким образом, основное преимущество включающий этот новый метод микродиссекции в протоколы изолятор является то, что клетки могут быть выделены из конкретных областей ткани, чтобы исключить загрязнение соседней ткани и клетки могут быть собраны непосредственно для анализа или культивированного для других приложений.
Метод микродиссекции описано здесь первая процедура в состоянии изолировать чистую популяцию живых клеток для использования в молекулярной и функционального анализа. Как показали Li др. 9, ПОИ, полученные с помощью этого метода можно культивировать и включены в различ?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Джеймса Oesterling для проточной цитометрии помощи. Это исследование было поддержано грантом Национального института рака США (R01-CA178380, ZY) и учебного гранта Национального института аспирантов (5T32CA009035-37, Lwy).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
PDL | Millipore | A-003-E | |
ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
DPBS | Gibco | 14190144 |