Summary

Cell Analyzer a base di impedenza in tempo reale come strumento per delineare molecolari meccanismi coinvolti nella neurotossicità e neuroprotezione in una linea cellulare neuronale

Published: August 09, 2014
doi:

Summary

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Abstract

Molti disturbi cerebrali connesse sono morte delle cellule neuronali coinvolti nella loro fisiopatologia. Migliorata di modelli in vitro per studiare gli effetti neuroprotettivi o neurotossici di farmaci e vie a valle coinvolti aiuterebbe ottenere informazioni sui meccanismi molecolari di neuroprotezione / neurotossicità e potrebbe potenzialmente facilitare lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, molti saggi di tossicità esistenti in vitro hanno importanti limitazioni – più valutare neurotossicità e neuroprotezione in un unico punto di tempo, non permettendo di osservare il tempo-corso e cinetica dell'effetto. Inoltre, la possibilità di raccogliere informazioni sulle vie di segnalazione a valle coinvolti nella neuroprotezione in tempo reale sarebbe di grande importanza. Nel protocollo corrente viene descritto l'uso di un analizzatore di cellule di impedenza-based in tempo reale per determinare gli effetti neuroprotettivi di serotonina 2A (5-HT 2A) agonisti dei recettori in una linea cellulare neuronale sotto senza etichetta e in tempo reale Conditioni che utilizzano misure di impedenza. Inoltre, abbiamo dimostrato che gli inibitori di secondi messaggeri percorsi possono essere usate per delineare molecole a valle che l'effetto neuroprotettivo. Noi descriviamo anche l'utilità di questa tecnica per determinare se un effetto sulla proliferazione cellulare contribuisce ad un effetto neuroprotettivo osservato. Il sistema utilizza piastre microelettronici speciali denominati E-tavole che contengono alternati matrici di microelettrodi d'oro sulla superficie inferiore dei pozzetti, che servono come sensori cellulari. La lettura impedenza viene modificato dal numero delle cellule aderenti, la vitalità cellulare, morfologia e adesione. Un parametro adimensionale chiamato cella indice è derivato dalle misure di impedenza elettrica e viene utilizzato per rappresentare lo stato delle cellule. Nel complesso, l'analizzatore di cellule di impedenza-based in tempo reale permette in tempo reale, la valutazione libero-label di neuroprotezione e neurotossicità, e la valutazione dei percorsi di coinvolgimento secondo messaggero, contribuendo a piùvalutazione dettagliata e high-throughput di potenziali composti neuroprotettivi in vitro, per la selezione dei candidati terapeutici.

Introduction

Morte cellulare neuronale svolge un ruolo critico nella fisiopatologia di molti disturbi cerebrali correlati 1. La disponibilità di throughput elevato e affidabile nelle prove di tossicità in vitro è fondamentale per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi di neurotossicità e per contribuire a selezionare le molecole neuroprotettive come candidati terapeutici in sviluppo dei farmaci 2. Tuttavia, ci sono molte limitazioni per più utilizzato in vitro neurotossicità assays.They valutare neurotossicità / neuroprotezione in una sola volta punto di non consentire la risoluzione cinetica; spesso utilizzare l'etichetta o la sonda che può interferire con le vie di segnalazione e limitare ulteriori studi nella stessa popolazione di cellule, e sono spesso ad alta intensità di manodopera, e in molti casi non forniscono informazioni meccanicistica. Nel presente studio abbiamo dimostrato l'utilità di un analizzatore di cellule di impedenza-based in tempo reale per determinare neurotossicità e neuroprotezione in una linea cellulare neuronale in tempo reale e sotto libero-labelcondizioni e forniscono informazioni sui meccanismi a valle attraverso l'analisi delle seconde vie messaggeri coinvolti nell'effetto.

Precedenti studi hanno confermato la validità dell'analizzatore cella in tempo reale per determinare la citotossicità nonché effetti sulla proliferazione cellulare in linee cellulari in confronto con tecniche standard 3,4,5,6. Ad esempio, una buona correlazione è stata osservata tra le letture della norma vitalità cellulare WST-1 test e cellulari valori dell'Indice in diversi punti del tempo in condizioni di proliferazione basali e dopo due diversi paradigmi tossici nelle cellule HeLa 3. In A549 e MDA-MB-231 cellule proliferazione e citotossicità provocato con il paclitaxel stabilizzatore microtubuli hanno mostrato valori molto simili quando valutati da misurazioni dell'indice cellulare e il modo standard utilizzato solforodamina B (SRB) test 4. Nella linea cellulare neuronale dei neuroni dell'ippocampo immortalati HT-22 cellule Indice misurazioni sono stati convalidati per la loro capacità to rilevare la proliferazione cellulare, glutammato citotossicità e citoprotezione contro il diffuso 3 (4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium-bromuro (MTT) 5. Nello stesso studio i risultati del test MTT e misurazioni Indice cellulare anche correlati bene in misura neuronale cellule progenitrici proliferazione, citotossicità dopo fattori di crescita deprivazione e salvataggio di citotossicità dal pan-caspasi inibitore QVD 5. Citotossicità indotta in cellule NIH 3T3 da Vandetanib (vascular endothelial growth factor recettore e inibitore del recettore del fattore di crescita epidermico) ha mostrato risultati simili misurati con i valori dell'Indice cellulare o neutro saggio di uptake rosso 6.

Abbiamo recentemente usato il sistema analizzatore di cellule in tempo reale per valutare gli effetti neuroprotettivi della 2A della serotonina (5-HT 2A) agonista del recettore cloridrato (±) -2,5-dimetossi-4-iodoamphetamine (DOI) in una linea cellulare neuronale ( cellule SK-N-SH) e screening per il coinvolgimento di second percorsi Messenger tramite il monitoraggio dell'effetto della loro inibizione chimica sulla neuroprotezione osservata 7. È interessante notare che il recettore 5-HT 2A ha agonisti sia allucinogeni e nonhallucinogenic (come il DOI e lisuride, rispettivamente), che possono attivare sia secondo percorsi comuni e distinte Messenger 8.

I vantaggi della tecnica sono presentati che permette di raccogliere informazioni in tempo reale sulla sopravvivenza cellulare nel corso dei giorni, per delineare percorsi di secondo messaggero coinvolti, per valutare il possibile contributo degli effetti proliferazione a neuroprotezione, e per selezionare un tempo ottimale per ulteriori studi end-point sulla stessa popolazione cellulare. Un diagramma schematico del flusso di lavoro nel protocollo attuale è presentato in figura 1.

Protocol

1 Preparazione Posizionare la stazione analizzatore cella in tempo reale di un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C e con il 5% di CO 2. Effettuare tutte movimentazione coltura cellulare e trattamenti farmacologici in una cappa coltura tissutale in condizioni sterili. NOTA: neuronale linee cellulari che richiedono diverse impostazioni di temperatura rispetto alle condizioni standard per la cultura, dovrebbero essere adeguati di conseguenza. Per le linee di cellule debolmente aderenti…

Representative Results

Deprivazione di siero porta a diminuire in cella i valori dell'Indice, che possono essere monitorati continuamente con l'analizzatore di cellule in tempo reale Stimoli neurotossici verso le cellule portano ad una diminuzione della cella i valori dell'Indice, che può essere monitorato in tempo reale con la tecnica presentata e la cui dinamica dipende dallo stimolo neurotossico specifica e il tipo di cella studiata. Figura 2 illustra l'a…

Discussion

Il protocollo attuale presenta l'utilità di un analizzatore di cellule in tempo reale per valutare in modo continuo e in condizioni di libera-label / gli effetti neurotossici neuroprotettivi dei composti in linee cellulari neuronali e al fine di conoscere le seconde vie messaggeri coinvolti nell'effetto.

Anche se l'utilità analizzatore di cellule in tempo reale di studiare la citotossicità e gli effetti dei farmaci sulla proliferazione cellulare è generalmente riconosciuto, s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.

We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
xCELLigence  RTCA SP system bundle ACEA Biosciences No: 00380601030 consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96 ACEA Biosciences No: 05232368001 for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells ATCC – (in partnership with LGC Standards) HTB-11 can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12  Sigma-Aldrich D8437 cell culture medium
fetal bovine serum Life Technologies 16140-063 supplements proliferation, but not serum deprivation medium
tisue culture flask T175 Sarstedt 83.1812.302  for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054 for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter Merck Millipore PHCC20060 automated cell counter
phosphate-buffered saline Life Technologies 10010-015 for washing the cells
(±)-DOI hydrochloride Sigma-Aldrich D101 5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294,002 hydrochloride Sigma-Aldrich L9908 PI3-K inhibitor for cell culture treatment 
lisuride maleate Tocris Bioscience 4052 compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D4540 for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate

Riferimenti

  1. Cavallucci, V., D’Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
  2. Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , (2007).
  3. Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
  4. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
  5. Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
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  7. Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
  8. González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
  9. Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
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Citazione di questo articolo
Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line. J. Vis. Exp. (90), e51748, doi:10.3791/51748 (2014).

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