Summary

Een protocol te infecteren<em> Caenorhabditis elegans</em> Met<em> Salmonella typhimurium</em

Published: June 26, 2014
doi:

Summary

C. elegans heeft zich ontpopt als een nieuwe genetische model om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol te infecteren C. elegans met Salmonella typhimurium combinatie met een dubbele streng RNAi interferentie techniek om de rol van ontvangende genen bij afweer tegen Salmonella infectie onderzocht.

Abstract

In het laatste decennium, C. elegans heeft zich ontpopt als een ongewerveld organisme om interacties tussen gastheren en ziekteverwekkers te bestuderen, met inbegrip van de afweer tegen gram-negatieve bacterie Salmonella typhimurium. Salmonella stelt persistente infectie in de darm van C. elegans en resulteert in vroege dood van de besmette dieren. Een aantal immuniteitsmechanismen geïdentificeerd in C. elegans te verdedigen tegen Salmonella infecties. Autophagy, een evolutionair geconserveerd lysosomale afbraak route, is aangetoond dat de Salmonella replicatie in C. beperken elegans en zoogdieren. Hier wordt een protocol beschreven te infecteren C. elegans met Salmonella typhimurium, waarbij de wormen worden blootgesteld aan Salmonella gedurende een beperkte tijd, vergelijkbaar met Salmonella-infectie bij mensen. Salmonella infectie aanzienlijk verkort de levensduur van C. elegans </ Em>. De essentiële Autofagie gen BEC-1 als voorbeeld, combineerden we deze infectie methode C. elegans RNAi voeden benadering en toonde dit protocol kan worden gebruikt om de functie van C. onderzocht elegans genen van de gastheer in de verdediging tegen Salmonella infectie. Sinds C. elegans hele genoom RNAi bibliotheken beschikbaar zijn, dit protocol maakt het mogelijk om uitgebreid te screenen op C. elegans genen die beschermen tegen Salmonella en andere intestinale pathogenen met behulp van genoom-brede RNAi bibliotheken.

Introduction

De vrijlevende bodem nematode Caenorhabditis elegans is een eenvoudige en genetisch handelbaar modelorganisme gebruikt voor vele biologische vraagstukken te bestuderen. C. elegans overwegend bestaat als zelfbemestende hermafrodieten. Mannetjes worden spontaan gegenereerd door niet-scheiding van het X-chromosoom tijdens gametogenese 1,2. In aanwezigheid van overvloedig voedsel, C. elegans voortdurend te ontwikkelen door middel van vier larvale stadia tot volwassene. Temperatuur beïnvloedt ook C. elegans ontwikkeling; snellere ontwikkeling waargenomen bij hogere temperaturen. In het laboratorium, C. elegans is gekweekt bij een standaard temperatuur van 20 ° C op agar platen met zaadjes bacterie Escherichia coli (stam OP50) als voedsel 1,2.

In het laatste decennium, C. elegans heeft zich ontpopt als een ongewerveld organisme om gastheer-pathogeen interacties 3-5 te bestuderen. In de natuur, C. elegans eet bacteriën als nutrient bron 1,2. De normale bacteriële laboratorium voedsel, OP50, kan gemakkelijk worden vervangen door andere pathogenen om de interactie tussen C onderzocht elegans en elke gewenste pathogeen. Onder deze omstandigheden, de darm is de primaire plaats van de infectie. Inderdaad, een groot aantal bacteriële pathogenen aangetoond dodelijk infecteren C. elegans 3-5.

De Gram-negatieve bacterie Salmonella is een gastro-intestinale ziekteverwekker die menselijk voedsel overgedragen ziekte veroorzaakt wereldwijd 6,7. C. elegans is een goed model gastheer voor Salmonella typhimurium als deze bacterie repliceert en vertoont aanhoudende darminfecties 8-10. C. elegans is gebruikt om zowel nieuwe identificatie en eerder bekende Salmonella virulentiefactoren 11. Interessant is dat de C. elegans immuunsysteem succes beperkt Salmonella replicatie. Eerder is gerapporteerd dat inhibvulle van autofagie genen maakt verhoogde Salmonella replicatie in C. elegans, resulterend in vroege dood van geïnfecteerde wormen 10. Macroautofagie (hierna autophagy) is een dynamisch proces, waarbij de herschikking van subcellulaire membranen cytoplasma en organellen sekwestreren voor levering aan het lysosoom voor afbraak 12. Autophagy is gemeld dat de Salmonella replicatie in C. beperken elegans en zoogdieren 10,13.

De C. elegans genoom was de eerste meercellige eukaryote genoom in kaart gebracht; Het reageert op RNAi behandeling 14-16. Bovendien kan RNAi effectief worden beheerd door het onderwerpen wormen bacteriën die de dubbelstrengs RNA van doelwitgen, bekend als RNAi voeden 16,17 innemen. Hele genoom RNAi voeden bibliotheken zijn gegenereerd voor genoom-brede RNAi screening 16,18. Hierin, een Salmonella-infectie proprotocol is gekoppeld RNAi voeden beproefd C. toestaan elegans genen van belang vanwege hun vermogen om te beschermen tegen Salmonella infectie.

Protocol

1. XLD (Xylose Lysine desoxycholaat) Agar Plates XLD agar is een selectieve groei medium voor Salmonella, die verschijnt als zwarte kolonies op XLD agar platen. Echter, als er geen problemen van verontreiniging, bijvoorbeeld een LB plaat kan worden vervangen. Weeg 5,5 g XLD agar en resuspendeer in 5 ml gedeïoniseerd water. Meng grondig tot alle agar is nat. Voeg 95 ml gedemineraliseerd water tot alle klontjes zijn verdwenen en het medium is volledig geresuspend…

Representative Results

Bij 20 ° C, de gemiddelde levensduur van wild-type N2 wormen is 17 dagen (Figuur 2A en tabel 2). Salmonella-infectie vermindert aanzienlijk de mediane levensduur van N2 wormen tot 10,5 dagen (p = 0,0002, log-rank test) (Figuur 2A ). Als een C. elegans gen een belangrijke rol in de verdediging tegen Salmonella infectie speelt, wordt voorspeld dat de remming gevoeligheid zal geven Salmonella infectie. In fe…

Discussion

C. elegans is een eenvoudige genetisch modelorganisme dat bacteriën eet als bron van voedingsstoffen. Zo is het gemakkelijk om de normale bacteriële voedsel te vervangen door een intestinale pathogeen interacties tussen C. onderzoeken elegans en de gekozen pathogeen. Hierin een protocol wordt beschreven aan Salmonella-infectie en C. combineren elegans RNAi voeden behandeling om de rol van ontvangende genen bij afweer tegen Salmonella infectie onderzocht. V…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken dr. Diane Baronas-Lowell voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant en een vergrijzende Scholarship van de Ellison Medical Foundation aan KJ

Materials

LB Broth Fisher BP9723-500
XLD agar EMD Chemicals 1.05287.0500
Bacto Agar Fisher DF0140-01-0
Peptone Fisher BP1420-500
Sodium Chloride Fisher S671-500
Calcium Chloride Fisher C69-500
Magnesium Sulfate Fisher M65-500
IPTG Gold Biotechnology 12481C50
Cholesterol Sigma C8667-25G
Ampicillin Fisher  BP1760-25
Salmonella typhimurium ATCC ATCC14028
Petri Dish 95 x 15mm Fisher FB0875714G
Petri Dish 60 x 15mm  Fisher 08-757-13A 
Falcon Serological pipet Fisher 13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid Fisher 13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator  Thermo Scientific SHKE6000-7
Incubator Percival I-36DL

Riferimenti

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
  2. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77, 71-94 (1974).
  3. Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
  4. Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
  5. Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
  6. Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
  7. Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
  8. Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
  9. Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
  10. Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
  11. Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
  12. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  13. Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
  14. . The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  15. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  16. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
  17. Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
  18. Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  20. Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
  21. Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).

Play Video

Citazione di questo articolo
Zhang, J., Jia, K. A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium. J. Vis. Exp. (88), e51703, doi:10.3791/51703 (2014).

View Video