Summary

Die Nutzung der Oropharyngeale Intratracheale PAMP Verwaltung und bronchoalveoläre Lavage, um die Immunantwort in Mäusen Bewerten

Published: April 02, 2014
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Summary

Die Immunantwort des Wirts auf Pathogen-Infektion ist eine streng reguliert Prozess. Mit Hilfe eines Lipopolysaccharid Lungenexpositionsmodell in Mäusen, ist es möglich, hochauflösende Auswertungen der komplexen Mechanismen der Krankheitsentstehung verbunden durch.

Abstract

Die Immunantwort auf Pathogene ist ein komplexer biologischer Vorgang. Die Mehrheit der in-vivo-Studien eingesetzt, um klassisch zu charakterisieren Wirt-Pathogen-Interaktionen nutzen intraperitoneale Injektionen von ausgewählten Bakterien oder Erreger associated molecular patterns (PAMPs) bei Mäusen. Während diese Techniken haben enorme Daten mit Infektionskrankheiten assoziiert Pathobiologie ergab, sind intraperitoneale Injektion Modelle nicht immer für Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien in der Lunge geeignet. Mit Hilfe einer akuten Lungenentzündungsmodell bei Mäusen, ist es möglich, eine hochauflösende Analyse der Host angeborenen Immunantwort Verwendung Lipopolysaccharide (LPS) durchzuführen. Hier beschreiben wir die Methoden, um LPS verwalten mit nicht-chirurgischen oropharyngeal intratracheale Verwaltung, Überwachung klinischer Parameter mit der Krankheitsentstehung verbunden sind, und nutzen bronchoalveolären Lavage, um die Immunantwort zu beurteilen. Die Techniken, die beschrieben werden,sind weit für das Studium der Wirt angeborenen Immunantwort auf ein breites Spektrum von PAMPs und Pathogene. Ebenso können mit kleineren Modifikationen dieser Techniken können auch in Studien, die allergische Entzündung der Atemwege und in pharmakologischen Anwendungen eingesetzt werden.

Introduction

Pulmonale Infektionen mit pathogenen Bakterienspezies verbunden sind, sind eine häufige Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit. Die Bestimmung der Mechanismen, die die Immunantwort auf diese Krankheitserreger treiben die Entwicklung von neuen Präventionsstrategien und Therapeutika, die die Auswirkungen dieser Infektionen dämpft fördern. Das übergeordnete Ziel des hier beschriebenen Protokolls ist es, den Anwender mit einer flexiblen Verfahren zu schaffen, zu bewerten, den Host angeborenen Immunantwort auf Krankheitserreger Infektion mit einem Erregermuster (PAMP) als Surrogat für die lebenden Bakterien. Die Mehrheit der früheren Studien, die die Host angeborenen Immunantwort auf Bakterien auf peritoneale Modelle aufgrund der relativen Leichtigkeit der Ausführung konzentriert. Während diese Modelle sind sehr nützlich und in bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet der Wirt-Pathogen-Interaktionen und systemischen Entzündung geführt hat, sind die aus diesen Modellen generierten Daten nicht immer für die entsprechenden Studien involving der Atemwege. Dabei wird ein Modell der akuten Lungenlungenentzündung als praktische und klinisch relevante Ausdehnung der klassischen intraperitoneale (ip) Injektion Modelle vorgeschlagen. Die vorgeschlagene Technik ermöglicht die lokale Bewertung der angeborenen Immunantwort bei einem organspezifischen Modellsystem.

Die hier beschriebenen Verfahren sind für eine einfache und robuste Technik, um Benutzern, die Immunantwort des Wirts auf LPS, die eine gemeinsame PAMP ist, beurteilen zu können. Die Methoden basieren auf intratracheale (IT) Instillation von LPS, die eine robuste angeborene Immunantwort in den Lungen von Mäusen und ahmt viele der in menschlichen Patienten, die an Infektionen der Atemwege und akuter Lungenverletzung 1 beobachtet pathophysiologische Funktionen induziert basiert. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es dem Benutzer, den Host-Immunantwort ohne die Störfaktoren und Sicherheitsbedenken bei der Durchführung in vivo Studien verbunden zu bewertenmit lebenden Bakterien. Auch die Mund-Rachen es Verwaltung Weg der Exposition in diesem Protokoll beschrieben ist, hat erhebliche Vorteile gegenüber anderen häufig verwendeten Techniken, einschließlich intranasale (in) Verwaltung und chirurgische es Verwaltung. Zum Beispiel ermöglicht es oropharyngealen Verabreichung relativ genaue Dosierung und Lungenablagerung im Vergleich zu in der Verwaltung, die in der Regel leidet erhöhte Variabilität Lung durch den Verlust von Mitteln in der Nasenhöhle und Nasennebenhöhlen 2-4. Die IT-Administration Route umgeht diese Hohlräume und ermöglicht den direkten Zugriff auf die Luftröhre und der Atemwege. Ebenso ist es die chirurgische Ansatz eine deutlich krankhaften Verabreichungsmethode und erfordert umfangreiche Ausbildung zu meistern. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen auch eine Beschreibung der gemeinsamen Techniken und Surrogat-Marker verwendet, um Entzündung Progression zu bewerten und am Ende mit einem Protokoll beschreibt die richtigen Techniken für die Vorbereitung der lungs für die Histopathologie Einschätzungen. Diese Protokolle basieren auf der Minimierung der Anzahl der Mäuse durch Maximierung der von jedem einzelnen Tier gewonnenen Daten für jede Studie erforderlich konzentriert.

Die beschriebenen Protokolle sind sehr flexibel und kann leicht geändert werden, um ein breites Spektrum und die damit verbundenen Schäden PAMPs molekulare Muster (gedämpft) zu beurteilen. Außerdem mit ein paar zusätzliche Modifikationen, diese Protokolle auch auf Studien, die allergischen Atemwegskrankheitsprogression oder Wirt-Pathogen-Interaktionen mit lebenden Bakterien, Viren oder Pilzen 5-10 angewendet werden.

Protocol

Alle Untersuchungen wurden im Rahmen der Genehmigung des Institutional Care und Verwenden Committee (IACUC) für Virginia Tech und in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. 1. Intratracheale (es) Inokulation von LPS Mit Oropharyngeale Verwaltung Stellen Sie sicher, dass jedes Tier ist einzigartig entweder ein Ohr Schlag, Ohrmarke oder andere institutionell anerkannte Methode identifiziert. </…

Representative Results

Die Zellwände von Gram-negativen Bakterien von LPS, die sehr reichlich in der Umgebung besteht. Inhalation von LPS in sensiblen menschlichen Populationen verschlimmert Atemwegs-Reaktivität und kann zur Auslösung einer Immun response11 robust. LPS ist auch eine gemeinsame PAMP im Mausmodell verwendet, um eine robuste angeborene Immunantwort hervorzurufen. In der hier beschriebenen Protokoll erhielten die Mäuse eine Dosis von LPS es isoliert aus E. coli (Serotyp 0111: B4) mit oropharyngealen es Verwaltung. Be…

Discussion

Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Bewertung der Immunantwort in der Maus Lunge ist wie folgt: 1) wählen Sie die entsprechende Maus-Stamm und Geschlecht für das Modell evaluiert; 2) Optimierung PAMP Lieferung in die Lunge; 3) richtig sammeln und verarbeiten die BALF; und 4) richtig fix und bereiten der Lunge für eine histopathologische Einschätzungen.

Die Auswahl des Maus-Stamm ist ein wichtiger Faktor bei der Bewertung der Immunantwort. C57BL / 6 Mäuse sind in der Regel als…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken der VA-MD Regional College of Veterinary Medicine für die Bereitstellung von Kern-und technische Unterstützung für dieses Projekt. Diese Arbeit wird durch ein NIH Career Development Award (K01DK092355) unterstützt.

Materials

C57Bl/6J The Jackson Laboratory Stock 000664
Compact Scale Ohaus Scale Corporation 71142845
Small Animal Rectal Thermometer Braintree Scientific TH 5
Rectal Probe for Rodents Braintree Scientific RET 3
Ear Punch Braintree Scientific EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 InvivoGen LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-023
Isoflurane Baxter 40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand ICAP Manufacturing n/a
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific RIS 100
Scissors (blunt/sharp) Fisher Scientific 13-806-2
forceps (straight) Fisher Scientific 22-327-379
forceps (45º, curved) Fisher Scientific 10-275
Scissors (blunt/blunt) Fisher Scientific 08-940
Pipette (200 µl Capacity) Gilson F123601
Ethanol Sigma 459844
 1 ml Syringe BD Medical 301025
10 ml Syringe BD Medical 301604
27 G x 0.5 in. needle BD Medical 305109
Refrigerated Microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter Harvard Apparatus 732836
Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture Ethicon A183
Luer to Tube Connector Kits Harvard Apparatus 721406
Luer Stopcock Kit Harvard Apparatus 721664
Tygon formula E-3603 laboratory tubing Sigma R-3603
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 560478
Hemacytometer Hausser Scientific 3520
Hemacytometer Cover Glasses Thermo Scientific 22-021-801 
Trypan Blue Thermo Scientific SV3008401
Cytology Funel Clips Fisher Scientific 10-357
Cytology Funels Fisher Scientific 10-354
Filter Cards Fisher Scientific 22-030-410
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
Cover Glasses Fisher Scientific 12-540A
Cytospin Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 
Diff Quick Staining Kit Fisher Scientific 47733150
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500

Riferimenti

  1. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
  2. Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
  3. Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
  4. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
  5. Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
  6. Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
  7. Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
  8. Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
  9. Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
  10. Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
  11. Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
  12. Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).

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Citazione di questo articolo
Allen, I. C. The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice. J. Vis. Exp. (86), e51391, doi:10.3791/51391 (2014).

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