基于偏振的全内反射荧光显微镜(pTIRFM)实现实时检测细胞膜动力学。本文介绍pTIRFM的膜重塑的过程中调节胞吐作用的研究落实。该技术推广到在细胞生物学中的其他进程直接或间接地涉及改变膜的形状。
为了获得新的见解胞吐作用的动态,我们组的重点是必须的囊泡与质膜融合过程中精确调节的变化,脂质双分子层的形状。这些快速和局部的变化是由脂类和控制膜曲率特殊蛋白质之间的动态相互作用实现的。如果没有这样的互动,不仅有囊泡融合带来灾难性的后果,但许多涉及膜的形状控制的其他细胞功能。近年来,一些具有膜成形性的蛋白质的身份已被确定。还有什么缺少的是何时,何地,以及如何作为融合和内容发布进步的路线图。
我们的分子事件,使膜重塑的理解历来由缺乏的是膜曲率敏感或具有时间分辨率为TRAC分析方法的限制K表的快速变化。 PTIRFM满足这两个条件。我们讨论pTIRFM是如何实现的可视化和解释快速,亚微米变化,嗜铬细胞膜的过程中致密核心囊泡(DCV)融合的方向。我们使用的嗜铬细胞是从牛肾上腺隔离。将膜染色的亲脂性羰花青染料,1,1' – 双十八烷基-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine,4 – 氯苯或没有。没在膜平面内插层具有“固定”的取向,因此是敏感的渐逝场的极化。在做染色细胞膜兴奋依次用561 nm激光(p-偏振分量,S-POL)的正交极化。 488 nm激光是用于可视化囊泡成分和时间融合的时刻。胞吐作用是通过局部灌注细胞去极化的KCl溶液触发。分析是使用自定义编写的软件,了解如何做离线执行排放强度的变化与融合孔的扩张。
胞吐作用的正确执行,需要在双层膜的形状极端的变化,必须精确地策划。在融合前,质膜的颗粒下局部弯曲时,部分地减少对双层膜的相互作用的能量势垒。后来,随着膜融合,产生高曲率的区域,必须稳定。最后,熔融膜必须弯曲了他们的初始形态,扩大融合孔,使内容发布1。因为单靠膜是不太可能发生如此戏剧性的和协调的变化,蛋白质是必要的调解活动。但他们如何行动在融合过程来影响改变膜拓扑保持非常开放的问题。
优良的体外模型存在可视化膜曲率。利用负染EM,例如,一直重要的整形目前分子模型的两个主要贩卖P上的操作roteins -突触结合蛋白和动力素(综述参见查普曼2和亨肖3)。胞吐的大多数实时检测不直接检测曲率。相反,曲率是从实验上腔货物放行4-8或改变膜面积9-11动力学的报告推断。 PTIRFM通过桥接实现直接,实时改变膜微观形貌测量在体内和体外研究之间的差距。
PTIRFM,在非成像模式,开创了由阿克塞尔罗德和他的同事测量NPD-PE的内部模型膜12结合的方向。该技术随后应用于可视化标记DII和FM1-43 13-18活细胞的动态变化。在pTIRFM,2渐逝场的偏振被用于顺序地激发一个膜包埋探针:p偏振(在入射面)和s偏振(垂直于入射平面)。在成像之前,探针 – 在这种情况下,没有 – 简要地加入到细胞外介质,并允许在被研究的细胞的细胞膜,以相互插入。在区域,其中所述膜是不平行的玻璃罩(如在膜的皱褶或凹陷)时,DID也将是不平行的。因此,这些区域将是可激发的p-偏振的光束。在p-偏振的光束会少有效地激发做膜的地区大多是平行于玻璃罩的。像素到像素的图像比例(P / S)汇报从根本将因此特别强调膜变形的区域连续p和s极化激发射。从理论上讲,在P / S比率的图像是敏感的,即使小的玻璃罩质膜偏差,用计算机模拟18所预测的变化幅度的角度。P / S的图像也独立于盖玻片表面的荧光团距离的和当地的荧光浓度。本地的荧光团浓度,而不是通过图像上的像素到像素的总和为P发射的和2倍的S排出量(P 2 S)的报告提供。在P 2 s测量是缩进的精确几何形状敏感,具有一定的,很少,或没有变化成为可能。这可以通过计算机模拟证明,一个融合孔从早期( 即用细颈)到更高的状态16,18的模式转变。在P通过一个狭窄的颈部连接于质膜的稠囊泡2 S(和更确实接近的界面)被预测为更大,例如,比稠囊泡具有宽得多的孔隙(其中的确是渐逝场的最暗部分内)。
在这篇文章中,我们将讨论pTIRFM是如何实现的,并用来研究膜形状时融合孔的扩张所发生的迅速,局部变化。虽然只有一个应用程序是明确的二scussed,该方法推广到其他各种细胞生物学过程的直接或间接涉及膜重塑。
基于偏振的TIRFM检测膜拓扑快速,微观的变化。实施该技术是比较简单的,特别是如果全内反射荧光光学系统已经到位。所有需要的是一个四分之一波片,两个偏振立方体,和百叶窗分离P-偏振分量和s-偏振的照明路径。这些组件的桌子上的精确位置通常是由可用空间决定。
为了获得膜的拓扑信息,所使用的荧光探针应相互插入一个固定的或已知的方位。的技术中,如本文中所描述,假设使用羰花青染料,但其它染料,如FM1-43 14,也可以使用。膜染色过程本身很简单。培养的细胞只需要很短的曝光(小于10秒),以没得到膜的旺盛标签少量DII /的。加入过量的染料导致光散射AGGREG阿泰上降低影像质量的玻璃。过温育细胞与染料导致染料内在这对图像质量和可能的细胞存活力的有害影响。如果一个细胞染色好,就会有明显的区别在P和S发射图像。 如图2A所示 ,在P发射将生动地突出显示该膜的那是盖玻片倾斜( 即小区覆盖区的边缘),而S的发光强度将大致均匀的细胞足迹区域。如果P和S之间的明显区别是看不出来的,那么它有可能是细胞粘附较差的底物或细胞膜是不健康的,并且该单元不用于实验。
我们以前的研究说明pTIRFM利用DII作为荧光膜探针。这里,我们利用这样做是因为它适合于采用GFP / pHluorin作为其它荧光团的双色成像实验。我们激发做无线TH一个561纳米的激光,而不是640 nm激光(这是更接近其激发峰),因为荧光漂白剂更迅速地在640nm。尽管在561 nm的激光是在没公布的激发光谱,荧光被有效地发射的尾巴。在561 nm激光的另一个优点是,它激发两个DII,也使我们能够使用相同的偏振设置两个探针。请注意,在膜中的荧光基团的取向会影响膜的拓扑结构的解释。例如,如果荧光团进行了垂直于膜面取向的,其过渡偶极子(而不是平行或几乎平行的,因为是与DII或者没有的情况下),那么非平面的膜的区域,则可更容易由S突出,而不是在P排放。
我们还描述的技术用于分离牛肾上腺嗜铬细胞和电穿孔。牛嗜铬细胞是优异的Secretory模型。它具有易于在文化,响应各种分泌剂的维护,并具有可随时可视化与传统光学显微镜大型分泌囊泡的优势。表达荧光蛋白,将细胞铺在胶原处理过的培养皿之前,电穿孔悬浮液中。在我们的经验,表达效率要高得多与电穿孔比用任一的Ca 2 +的磷酸盐或脂质体转染试剂。电穿孔的缺点是,它需要更多的细胞(如多不进程存活)和昂贵的商业试剂。对于原因尚不清楚对我们来说,不是每一个膜结合一样。另外,在烹调的细胞中,只有一小部分被转染。发现转染与染色以及用做细胞可以是费时这就是为什么优化染色和电是非常值得的努力情况。
总之,这是一个rticle描述pTIRFM是如何实现的监测融合在嗜铬细胞致密核心囊泡的过程中发生的快速和局部的膜的变形。虽然只有一个应用进行了讨论,该技术是非常适合的,涉及改变膜的形状,包括细胞内吞作用,细胞分裂和细胞运动等生物过程的研究。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由美国心脏协会和启动资金由美国韦恩州立大学AA支持的国家科学家开发格兰特(13SDG14420049)。我们非常感激医生罗纳德W.霍尔茨和玛丽·比特纳博士提供有关牛肾上腺准备和丹尼尔·阿克塞尔罗德博士与pTIRFM设置和对稿件的意见非常有用的援助建议。SYT-1 pHluorin是与使用下吕Miesenbock博士(牛津大学)的许可。 GCAMP5G通过Addgene获得的。我们感谢詹姆斯·泰勒,Tejeshwar饶,雷切尔L.艾克曼,以及Praneeth Katrapti与优化各个步骤的描述的程序的帮助。
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |