Högkvalitativt totalt RNA har förberetts från cellkroppar av mus ryggmärg motor nervceller genom laser fånga mikrodissektion efter färgning ryggmärg avsnitt med Azure B i 70% etanol. Tillräckligt med RNA (~40-60 ng) återvinns från 3 000-4 000 motoriska nervceller för att möjliggöra nedströms RNA-analys av RNA-seq och qRT-PCR.
Beredning av högkvalitativt RNA från celler av intresse är avgörande för exakt och meningsfull analys av transkriptionella skillnader mellan celltyper eller mellan samma celltyp i hälsa och sjukdom eller efter farmakologiska behandlingar. I ryggmärgen kompliceras sådana preparat från motoriska nervceller, målet för intresse för många neurologiska och neurodegenerativa sjukdomar, av det faktum att motoriska nervceller representerar <10% av den totala cellpopulationen. Laser capture microdissection (LMD) har utvecklats för att lösa detta problem. Här beskriver vi ett protokoll för att snabbt återställa, frysa och dela upp mus ryggmärg för att undvika RNA skador av endogena och exogena RNases, följt av färgning med Azure B i 70% etanol för att identifiera motoriska nervceller samtidigt hålla endogena RNase hämmas. LMD används sedan för att fånga de färgade nervcellerna direkt i guanidin tiocyanat lysis buffert, upprätthålla RNA integritet. Standardtekniker används för att återställa det totala RNA och mäta dess integritet. Detta material kan sedan användas för nedströmsanalys av transkriptionerna av RNA-seq och qRT-PCR.
I däggdjursvävnader som består av flera olika celltyper har tillkomsten av LMD-instrument (Laser Capture Microdissection) gett möjlighet att välja en specifik celltyp för analys på RNA- eller proteinnivå. För närvarande möjliggör förstärkning och nästa generations sekvenseringstekniker användning av en pool av totalt RNA från några tusen celler för att få en relativt grundlig inventering av transkriptomen, inklusive bedömning av relativa nivåer av RNA och identifiering av olika skarvade former. Hittills kommer proteomiska analyser av några tusen celler att nå ner genom endast mer rikliga arter. Till exempel har vi identifierat <1 000 av de vanligaste proteinerna från 3 000-4 000 motoriska neuroncellkroppar (visas inte), och Zhu och medarbetare har nyligen rapporterat att de identifierar 2 665 proteiner från ~ 15 000 tumörceller1. Med ytterligare utveckling av masspektrometri är det dock troligt att sådana analyser kommer att sträcka sig till mycket större djup.
Här presenterar vi ett specifikt protokoll som används för LMD av motoriska neuroncellkroppar från ryggmärg av möss, följt av förberedelse av RNA. Detta protokoll användes i samband med jämförelse av RNAs från motoriska nervceller av presymtomatiska transgena mutanta superoxid dismutas (SOD)1 amyotrofisk laterala skleros (ALS) möss med RNAs beredda från en vild typ SOD1 transgen stam av både RNA-seq och qRT-PCR validering2. I synnerhet utgör motoriska nervceller, i det främre hornet av den grå materian i ryggmärgen, <10% av den totala cellpopulationen, omgiven av ett hav av astrocyter, och som sådan kan deras transkriptionsprofil inte lätt dekonvoluteras från studier av hela sladden. En laser capture strategi är således idealisk för att analysera RNA uttryck i dessa celler, med fysiologi bevaras genom snabbt excising och frysning av sladden efter kort intracardiac saltlösning perfusion. Motorisk neuron somata är stor och är därmed lätt detekterbar, här med hjälp av ett färgämne som har stark affinitet för nervceller3. Dessutom, med en sådan storlek, ger dessa celler en relativt stor mängd RNA per cell fångad. Förfarandet som används, som beskrivs nedan, kan lätt justeras för att erhålla andra neuronala celltyper, liksom potentiellt andra celltyper, särskilt identifierade antingen genom färgfärgningsteknik eller genom antikroppsfärgning.
Det viktigaste måttet på framgång för detta protokoll för att producera totalt RNA genom lasermikrodissektion av ryggmärgsskivor är RIN-värdet5. För RNA-prover från högre eukaryoter ger värden över 8,5 regelbundet högkvalitativa sekvenserings- och qRT-PCR-data. Om utbytet är lågt men kvaliteten är hög, upprepa preparatet. Om integriteten är lägre (även 7,5-8), är det dock bättre att hitta källan till problemet och försöka igen. Det finns många steg där något kan gå fel, men egentligen bara två källor till problemet – endogen RNase-förorening eller exogen RNase-förorening. Den första kan hanteras genom övning, så att tiden från musens offer till frysning av dess O.C.T-inbäddade sladd minimeras. Den andra punkten i protokollet där endogena RNase kan bidra till ett dåligt resultat är under beredningen av skivorna. Varje skiva ska hålla sig till en pen-bild i rumstemperatur snabbt, men den smälter (O.C.T blir klar). Ju snabbare skivan kan återerrosas desto bättre. Kryostaten vi använder har plana ytor inuti kammaren som ligger på -20 °C, som vi använder för att snabbt frysa skivan igen. Hitta en liknande plats i kryostaten som används och se till att skivan blir ogenomskinlig igen snabbt.
Att spåra källor till exogena RNase kan vara svårt, eftersom det finns så många möjligheter. De enda reagenser som används som inte uttryckligen är RNase-fria är O.C.T. och Azure B. Om Azure B har fungerat tillfredsställande tidigare kan du prova en ny flaska O.C.T., även om det här reagenset aldrig har varit ett problem. RNase-fria reagenser kan också bytas ut, även från en annan leverantör. En mycket troligare källa är utredaren. Förutom en grundlig sanering av arbetsområdet är det ofta användbart att en annan labbmedlem följer med och observerar alla steg i proceduren. Även om detta är någon som inte rutinmässigt utför denna procedur, kan en ny uppsättning ögon plocka upp en annars obemärkt föroreningskälla.
Att utvidga detta protokoll till att återställa RNA från andra ryggmärgsceller, från ryggmärgsceller från andra arter eller från specifika celltyper i andra organ kommer att kräva modifieringar inom flera områden som är inriktade på att uppnå tydlig identifiering av de celler som är av intresse samtidigt som man undanrömar, eller åtminstone minimerar, effekten av endogena RNase. I protokollet här tillät snabb borttagning och frysning av sladden, tillsammans med Azure B-färgning i 70% etanol, både minimering av RNA-nedbrytning och enkel identifiering av motoriska neuroncellkroppar. Azure B är en väletablerad histokemisk fläck för nervceller som verkar binda till RNA3 och har använts för att utvärdera RNA-innehåll av nervceller i obduktionsprover av hjärnvävnad från patienter med neurodegenerativ sjukdom6. Noterbart var att Azure B-färgning varken påverkade integriteten hos det renade RNA eller dess förmåga att omfördelad och analyseras. Andra färgämnen, såsom cresylviolett 7 och toluidinblått8 har använts i liknande LMD-protokoll. Samla cellkropparna direkt i guanidin tiocyanat lösning som de dissekerades förutsatt att det sista steget som resulterade i rutinmässig återhämtning av intakt RNA.
Liknande metoder kan föreställas för andra celler och organ, erkänna att identifiera celler av intresse samtidigt minimera eller helst förhindra RNA nedbrytning av endogena RNases är det kritiska kravet för framgångsrik analys. I vävnader som har höga nivåer av RNase, såsom bukspottkörtel, snabb hantering och låg temperatur har kombinerats för att möjliggöra återhämtning av RNA från β-celler, dra nytta av deras naturliga autofluorescens för visualisering9. Förfaranden med antikroppsfärgning för identifiering har ocksårapporterats 10, men har inte varit helt framgångsrika i våra händer. Slutligen finns många musmodeller tillgängliga som uttrycker fluorescerande fusionsproteiner (dvs. GFP, YFP, RFP) i celler av intresse, som kan användas för att identifiera demi vävnadssektioner på LMD-mikroskopet. Faktum är att de musstammar vi har analyserat med detta protokoll uttrycker ett fusionsprotein mellan SOD1 och YFP11, och deras ryggmärgsmotorneuroner är mycket fluorescerande. Vi kunde dock inte hitta en uppsättning etanoltvättar och / eller uttorkningsförhållanden som samtidigt skulle ta bort O.C.T., hämma RNase-aktiviteten och konsekvent upprätthålla tillräcklig YFP-fluorescens för att möjliggöra visualisering av motoriska nervceller och deras återhämtning av LMD. Kanske kan ett nytt fluorescerande protein eller en variant av de tillgängliga som upprätthåller fluorescens i organiska lösningsmedel hittas för att övervinna denna begränsning.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka George Farr och medlemmar av Horwich lab för hjälpsamma diskussioner. Detta arbete stöddes av Howard Hughes Medical Institute.
Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |