Produktion von RNA für die Transkriptomische Analyse von Maus Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies durch Laser Capture Microdissection
Summary
Hochwertige Gesamt-RNA wurde aus Zellkörpern von Maus-Spinalmark-Motorneuronen mittels Lasercapture-Mikrodissektion hergestellt, nachdem Rückenmarksabschnitte mit Azure B in 70% Ethanol gefärbt wurden. Ausreichende RNA (ca. 40-60 ng) wird aus 3.000-4.000 motorischen Neuronen zurückgewonnen, um eine nachgeschaltete RNA-Analyse durch RNA-seq und qRT-PCR zu ermöglichen.
Abstract
Die Herstellung hochwertiger RNA aus von Interesse entosteilen Zellen ist entscheidend für eine präzise und aussagekräftige Analyse der Transkriptionsunterschiede zwischen Zelltypen oder zwischen demselben Zelltyp in Gesundheit und Krankheit oder nach pharmakologischen Behandlungen. Im Rückenmark wird eine solche Vorbereitung aus motorischen Neuronen, dem Ziel von Interesse an vielen neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen, durch die Tatsache erschwert, dass motorische Neuronen <10% der gesamten Zellpopulation ausmachen. Lasercapture Microdissection (LMD) wurde entwickelt, um dieses Problem zu lösen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur schnellen Wiederherstellung, Einfrierung und Schnittmaus Rückenmarks, um RNA-Schäden durch endogene und exogene RNasen zu vermeiden, gefolgt von Färbung mit Azure B in 70% Ethanol, um die motorischen Neuronen zu identifizieren, während endogene RNase gehemmt. LMD wird dann verwendet, um die gefärbten Neuronen direkt in Guanidin-Thiocyanat-Lyse-Puffer zu erfassen, die Integrität der RNA zu erhalten. Standardtechniken werden verwendet, um die gesamte RNA zurückzugewinnen und ihre Integrität zu messen. Dieses Material kann dann für die nachgelagerte Analyse der Transkripte durch RNA-seq und qRT-PCR verwendet werden.
Introduction
In Säugetiergeweben, die aus mehreren verschiedenen Zelltypen bestehen, hat das Aufkommen der Lasercapture Microdissection (LMD)-Instrumentierung die Möglichkeit, einen bestimmten Zelltyp für die Analyse auf RNA- oder Proteinebene auszuwählen. Derzeit ermöglichen Amplifikations- und Next-Gen-Sequenzierungstechniken die Verwendung eines Pools von RNA insgesamt aus einigen tausend Zellen, um eine relativ gründliche Bestandsaufnahme des Transkriptoms zu erhalten, einschließlich der Bewertung der relativen Konzentrationen von RNAs und der Identifizierung verschiedener gespleißter Formen. Bis heute werden Proteomik-Analysen von ein paar tausend Zellen nur durch mehr reichliche Arten reichen. Zum Beispiel haben wir <1.000 der am häufigsten vorkommenden Proteine aus 3.000-4.000 motorischen Neuronenkörpern identifiziert (nicht gezeigt), und Zhu und Kollegen haben kürzlich berichtet, dass sie 2.665 Proteine aus 15.000 Tumorzellen1identifiziert haben. Mit der weiteren Entwicklung der Massenspektrometrie ist es jedoch wahrscheinlich, dass sich solche Analysen bis weit in die Tiefe ausdehnen werden.
Hier stellen wir ein spezifisches Protokoll für LMD von motorischen Neuronenzellkörpern aus dem Rückenmark von Mäusen vor, gefolgt von der Vorbereitung von RNA. Dieses Protokoll wurde im Zusammenhang mit dem Vergleich von RNAs aus motorischen Neuronen präsymptomatischer transgener mutagener Superoxiddismutase (SOD)1 amyotrophe Lateralsklerose (ALS)-Mäuse mit RNAs verwendet, die aus einem wildtypen SOD1-Transgenstamm sowohl durch RNA-seq- als auch durch qRT-PCR-Validierung2hergestellt wurden. Insbesondere machen motorische Neuronen im vorderen Horn der grauen Substanz im Rückenmark <10% der gesamten Zellpopulation aus, umgeben von einem Meer von Astrozyten, und als solches lässt sich ihr Transkriptionsprofil nicht ohne weiteres aus Studien der gesamten Schnur entkrüsten. Ein Laser-Capture-Ansatz ist daher ideal für die Analyse der RNA-Expression in diesen Zellen, wobei die Physiologie durch schnelles Aus- und Einfrieren der Schnur nach kurzer intrakardialer Saline-Perfusion erhalten bleibt. Motorneuron somata sind groß und sind daher leicht nachweisbar, hier mit einem Farbstoff, der eine starke Affinität zu Neuronenhat 3. Darüber hinaus bieten diese Zellen bei einer solchen Größe eine relativ große Menge an RNA pro erfasster Zelle. Das verfahren, wie unten beschrieben, könnte leicht angepasst werden, um andere neuronale Zelltypen sowie potenziell andere Zelltypen zu erhalten, die speziell entweder durch Farbstofffärbungstechniken oder durch Antikörperfärbung identifiziert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das bedeutendste Erfolgsmaß dieses Protokolls zur Herstellung von Gesamt-RNA durch Lasermikrodissektion von Rückenmarksscheiben ist der RIN-Wert5. Bei RNA-Proben aus höheren Eukaryoten liefern Werte über 8,5 regelmäßig qualitativ hochwertige Sequenzierungs- und qRT-PCR-Daten. Wenn die Ausbeute gering ist, aber die Qualität hoch ist, wiederholen Sie die Zubereitung. Wenn die Integrität niedriger ist (auch 7,5-8), ist es jedoch besser, die Ursache des Problems zu finden und es erneut zu versuchen. Es gibt viele Schritte, bei denen etwas schief gehen kann, aber wirklich nur zwei Ursachen des Problems – die endogene RNase-Kontamination oder die exogene RNase-Kontamination. Die erste kann durch die Praxis angegangen werden, so dass die Zeit vom Opfer der Maus bis zum Einfrieren der O.C.T-eingebetteten Schnur minimiert wird. Der andere Punkt im Protokoll, bei dem endogene RNase zu einem schlechten Ergebnis beitragen kann, ist die Vorbereitung der Scheiben. Jede Scheibe sollte schnell an einem PEN-Schiebeschlitten haften, aber es schmilzt (das O.C.T wird klar). Je schneller die Scheibe eingefroren werden kann, desto besser. Der Kryostat, den wir verwenden, hat flache Oberflächen in der Kammer, die bei -20 °C liegen, die wir verwenden, um die Scheibe schnell wieder einzufrieren. Finden Sie eine ähnliche Stelle in der kryostat verwendet und stellen Sie sicher, dass die Scheibe schnell wieder undurchsichtig wird.
Das Aufspüren von Quellen exogener RNase kann schwierig sein, weil es so viele Möglichkeiten gibt. Die einzigen Reagenzien, die nicht ausdrücklich RNase-frei sind, sind O.C.T. und Azure B. Wenn Azure B zuvor zufriedenstellend abgeschnitten hat, probieren Sie eine frische Flasche O.C.T. aus, obwohl dieses Reagenz nie ein Problem war. RNasefreie Reagenzien können auch von einem anderen Lieferanten ersetzt werden. Eine viel wahrscheinlichere Quelle ist der Ermittler. Neben einer gründlichen Bereinigung des Arbeitsbereichs ist es oft sinnvoll, dass ein anderes Labormitglied mitverfolgt und alle Schritte im Verfahren beobachtet. Selbst wenn dies jemand ist, der dieses Verfahren nicht routinemäßig durchführt, kann ein neuer Satz von Augen eine ansonsten unbemerkte Quelle der Kontamination aufnehmen.
Die Ausweitung dieses Protokolls auf die Wiederherstellung von RNA aus anderen Rückenmarkszellen, von Rückenmarkszellen anderer Arten oder von bestimmten Zelltypen in anderen Organen erfordert Änderungen in mehreren Bereichen, die darauf ausgerichtet sind, eine klare Identifizierung der gefährdeten Zellen zu erreichen, während die Auswirkungen der endogenen RNase verhindert oder zumindest minimiert werden. Im Protokoll hier ermöglichte das schnelle Entfernen und Einfrieren der Schnur, gekoppelt mit Azure B Färbung in 70% Ethanol, sowohl die Minimierung des RNA-Abbaus als auch die einfache Identifizierung von motorischen Neuronenkörpern. Azure B ist ein etablierter histochemischer Fleck für Neuronen, der an RNA3 zu binden scheint und zur Bewertung des RNA-Gehalts von Neuronen in Autopsieproben von Hirngewebe von Patienten mit neurodegenerativer Erkrankung6verwendet wurde. Insbesondere hat die Azure B-Färbung weder die Integrität der gereinigten RNA noch ihre Fähigkeit, umgekehrt transkribiert und analysiert zu werden, beeinträchtigt. Andere Farbstoffe, wie Cresylviolett7 und Toluidin blau8 wurden in ähnlichen LMD-Protokollen verwendet. Das Sammeln der Zellkörper direkt in Guanidin-Thiocyanat-Lösung, wie sie seziert wurden, lieferte den letzten Schritt, der in der routinemäßigen Wiederherstellung von intakter RNA führte.
Ähnliche Ansätze können für andere Zellen und Organe vorgesehen werden, wobei anerkannt wird, dass die Identifizierung der von Interesse sindden Zellen bei gleichzeitiger Minimierung oder vorzugsweise Verhinderung des RNA-Abbaus durch endogene RNasen die entscheidende Voraussetzung für eine erfolgreiche Analyse ist. In Geweben mit hohem RNase-Gehalt, wie Bauchspeicheldrüse, schnelle Handhabung und niedrige Temperatur wurden kombiniert, um die Rückgewinnung von RNA aus β-Zellen zu ermöglichen, unter Ausnutzung ihrer natürlichen Autofluoreszenz für die Visualisierung9. Verfahren mit Antikörperfärbung zur Identifizierung wurden ebenfalls10berichtet, waren aber in unseren Händen nicht vollständig erfolgreich. Schließlich stehen viele Mausmodelle zur Verfügung, die fluoreszierende Fusionsproteine(z. B. GFP, YFP, RFP) in von Interesse beauftragenden Zellen ausdrücken, die verwendet werden könnten, um sie in Gewebeabschnitten auf dem LMD-Mikroskop zu identifizieren. In der Tat, die Maus Stämme, die wir mit diesem Protokoll analysiert haben, drücken ein Fusionsprotein zwischen SOD1 und YFP11aus, und ihre Spinalmark-Motorneuronen sind hochfluoreszierend. Wir waren jedoch nicht in der Lage, eine Reihe von Ethanolspülungen und/oder Dehydrierungsbedingungen zu finden, die gleichzeitig die O.C.T. entfernen, die RNase-Aktivität hemmen und konsequent eine ausreichende YFP-Fluoreszenz beibehalten würden, um eine Visualisierung der motorischen Neuronen und ihre Erholung durch LMD zu ermöglichen. Vielleicht kann ein neues fluoreszierendes Protein oder eine Variante der verfügbaren, die die Fluoreszenz in organischen Lösungsmitteln aufrechterhält, gefunden werden, um diese Einschränkung zu überwinden.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken George Farr und den Mitgliedern des Horwich-Labors für die hilfreichen Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom Howard Hughes Medical Institute unterstützt.
Materials
| Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
| Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
| Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
| LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
| RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
| RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
| Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
| Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
| PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
| RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
| RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
| 2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
| Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
| Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |
Riferimenti
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