형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

단순 포진 바이러스 타입 1 (HSV-1)은 복제하고 확산하기 위해 주기적으로 재 활성화되는 말초 신경계의 삼차 신경절 (TG)의 뉴런에서 장기 잠재 감염을 수립, 지속적인 인간의 신경성 바이러스입니다. HSV-1 유전자는 숙주 세포의 게놈 ^1,2에 통합하지 않는 다중 사본 chromatinized 플라스미드를 유지 호스트 신경 세포의 핵에있는 1백50킬로바이트 dsDNA의 지역화입니다. 대기 시간 동안, HSV-1 증식하는주기 유전 프로그램은 강력하게 억제하고, 유전자 발현이 지연 설립에서 재 활성화 ³ 개시의 지연에 관련된 성적 증명서 (LAT) 현장에 제한됩니다. LAT는 주요 2킬로바이트 안정 올가미로 처리 긴 8.5 KB 비 암호화 RNA, 그리고 몇 가지의 miRNA ^4-7을 생산하고 있습니다. HSV-1 지연 따라서 바이러스 게놈 DNA, LAT의 RNA, 및 검출 증식하는주기 단백질의 부재의 존재에 의해 특징입니다.

"ontent> 동물 모델을 주로 쥐와 토끼, 인간의 대기 시간의 몇 가지 기능을 recapitulating 실험 모델입니다. 그 모델의 주요 관심사 중 하나는 그들이 면역 호스트에서 HSV-1 대기의 생리 학적 측면을 연구 할 수 있다는 것입니다. 지난 수십 년 동안 이러한 유전자 변형 바이러스 및 마우스와 같은 많은 실험 도구, 생리학, 유전학, 동물 조직에서 HSV-1 대기의 세포 생물학을 연구하기 위해 개발되었다. 지금까지 바이러스 게놈 DNA가 검출과 정량 남부 오점으로되었다 해리 TGS에서 qPCR에가. 그러나, 현재 조직 섹션 ^8. 결과적으로, 대기 시간이 정기적으로 현장 하이브리드의 RNA에 의해 LAT RNA의 검출보다는 통해 조직 학적 섹션에 평가됩니다에 현장 하이브리드 화에 의해 HSV-1 유전자를 검출 할 수있는 방법이 없습니다 바이러스 게놈 검출.는 바이러스 게놈의 존재, 생에 근거 감염된 세포를 특성화하는 것이 불가능했기 때문에의 기술적 한계는 바이러스 게놈 세포 및 바이러스 유전자 발현 또는 숙주 세포 – 매개 면역 반응 ^9,10 사이의 관계와 같은 호스트 바이러스 상호 작용의 많은 양상의 분석에 중요한 결점이다.

가장 중요한 것은, 잠재 감염의 세포 간 이질성이 상대적으로 미개척 남아 있고 마우스와 SCID 마우스에 ^11-17로 이식 된 인간의 감각 신경절의 신경 세포 지연의 주요 기능이 될 것으로 나타났다. 일반적으로, 그것은 셀 당 HSV-1 유전자의 카피 수는 5에서 수백에 달라 qPCR에 의해 표시되었다. LAT는 대기 시간 및 재 활성화의 중요한 규칙으로 표시되지만, 고립 된 뉴런과 현장 PCR에서의 qPCR 데이터는 잠재적으로 감염된 신경 세포의 서브 세트 만, 낮은 30 %가, LAT 궤적 ^{11,12,18-21을} 표현하는 것으로 나타났다. 방법은 숙주 세포와 바이러스 레이턴시 스타일에 티슈 영향 내의 셀룰러 환경바이러스 성 유전자 발현이 불분명하게 남아있다. 여기에서 우리는 동물의 신경 조직 섹션 내에서 낮은 복사 HSV-1 게놈 DNA의 효율적인 검출을위한 현장 하이브리드 화 (물고기) 방식으로 강력한 형광을 설명합니다. 이 방법은 설계 및 숙주 세포 내 핵 부품 ^(22)과 함께 바이러스 게놈의 상호 작용을 연구하는 데 필요한 고해상도 현미경 이미징에 대한 액세스를 얻기 위해 우리가 사용되었다. 또한, 우리는 바이러스 유전자 발현을 조절 바이러스 호스트 상호 작용을 설명하기위한 유일한 도구이다 RNA 및 단백질과 바이러스 성 DNA의 동시 검출을위한 다수의 염색 방법을 서술. 상기 방법은 또한 다수의 섹션에 감염된 신경 정량화로서 HSV-1 잠상 게놈의 검출을 요구하는 분석의 넓은 범위에 적용될 수있다. 주요 단계는 하이브리드에 바이러스 DNA에 액세스 할 수 있도록 항원 검색 처리를 적용하는 것입니다. 따라서,이 프로토콜은 검출에 효율적입니다동물 조직 내에서 기존의 DNA-FISH 방식에 의해 현재 검출되지 않은 다른 dsDNA 바이러스의.