Mer än hälften av proteiner är små proteiner (molekylmassa <200 kDa) som utmanar både elektronmikroskop imaging och tredimensionella rekonstruktioner. Optimerad negativ färgning är en robust och hög genomströmning protokoll för att med hög kontrast och relativt hög upplösning (~ 1 nm) bilder av små asymmetriska proteiner eller komplex under olika fysiologiska förhållanden.
Strukturbestämning av proteiner är ganska utmanande för proteiner med molekylmassor mellan 40-200 kDa. Med tanke på att mer än hälften av naturliga proteiner har en molekylvikt mellan 40 till 200 kDa 1,2, behövs en robust och hög genomströmning metod med en nanometer upplösning kapacitet. Negativ färgning (NS) elektronmikroskopi (EM) är en enkel, snabb och kvalitativ metod som ofta har använts i forskningslaboratorier för att undersöka proteinstruktur och protein-proteininteraktioner. Tyvärr konventionella NS protokoll genererar ofta strukturella artefakter på proteiner, speciellt med lipoproteiner som vanligtvis bildar presentera rouleaux artefakter. Genom att använda bilder av lipoproteiner från kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) som standard, var de viktigaste parametrarna i NS provberedningsförhållanden nyligen skärmad och rapporteras som den optimerade NS-protokollet (OpNS), en modifierad konventionell NS-protokoll 3. Artefakter som rouleaux kan i hög grad begränsad av OpNS, dessutom ger hög kontrast tillsammans med någorlunda hög upplösning (nära 1 nm) bilder av små och asymmetriska proteiner. Dessa högupplösta och bilder med hög kontrast är även gynnsam för en enskild protein (ett enda objekt, ingen genomsnittlig) 3D-rekonstruktion, till exempel en kDa antikropp 160, genom metoden för elektron tomografi 4,5. Dessutom kan OpNS vara en hög genomströmning verktyg för att undersöka hundratals prover av små proteiner. Till exempel, den tidigare publicerade mekanism av 53 kDa kolesterylester-transferprotein (CETP) involverade screening och avbildning av hundratals prover 6. Med tanke på Cryo-EM sällan framgångsrikt bilder proteiner under 200 kDa har ännu inte publicera någon studie med screening över hundra provförhållanden, är det rimligt att kalla OpNS en hög genomströmning metod för att studera små proteiner. Förhoppningsvis OpNS protokollet presenteras här kan vara ett användbart verktyg för att tänja gränserna för EM och påskynda EM studier av små proteinstruktur, dynamik och mekanismer.
Förstå proteiners funktion kräver kunskap om proteinstruktur. Strukturbestämning är utmanande för proteiner vars molekylära massorna är inom 40-200 kDa. Röntgenkristallografi är begränsad av proteinkristallisering; kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi är begränsad till molekylmassor mindre än 40 kDa, medan kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) har svårt att både bild förvärv och tredimensionella (3D) rekonstruktioner av små proteiner som molekylmassor är mindre än 200 kDa. Noterbart är mer än 50% proteiner har en molekylmassa inom intervallet 40-200 kDa 1,2, eftersom dagens metoder är utmanande att studera proteiner av denna storlek, det behövs en ny metod.
Även om de flesta transmissionselektronmikroskop (TEMS) är kapabla atomär upplösning, det vill säga bättre än 3 Å upplösning, uppnå ens en nära nanometer upplösning struktur från ett biologiskt prov är ganska Challenging 7. Skador Strålning, låg kontrast, strukturella avvikelser samt artefakter såsom uttorkning alla hinder högupplösta TEM avbildning 3,8.
Bland olika TEM tillvägagångssätt är Cryo-EM en avancerad och banbrytande metod för att uppnå atomär upplösning strukturer mycket symmetriska stora makromolekyler i nära fysiologiska förhållanden 9-12. Den Cryo-EM prov bereds flash frysning provlösningen, bädda makromolekylerna i glaskroppen is, som sedan avbildas vid låga temperaturer såsom flytande kväve eller helium temperaturer 13. Cryo-EM är en fördel i det att prover presentera några artefakter och är nästan infödda struktur 8-12. Cryo-EM har sina nackdelar: i) ytterligare enheter krävs skall installeras eller köpa för att uppgradera en standard TEM instrument för en Cryo-EM kapacitet. Enheter är: anti contaminator, kryo-hållare, låg dos mode programvara och lågdos sensitiv CCD-kamera, även om priserna på dessa enheter är mycket lägre än priset på TEM själva instrumentet; ii) Cryo-EM drift behöver längre tid än NS operation. Undersöka en Cryo-EM provet kräver ofta längre tid att förbereda prover och driva TEM instrument än för NS eftersom Cryo-EM kräver itu ytterligare svårigheter, bland annat: operation flytande kväve temperatur, provladdning, imaging drift, temperaturgradienter, lågdos modell drift, provstrålningskänslighet och begränsningar doserings. Dessa extra åtgärder kommer att sakta ner hastigheten på förvärva användbara data jämfört med NS datainsamling, även om några Cryo-EM bilder kan säkert erhållas i 1 timme eller mindre av Cryo-EM experter med instrumentet beredd med en balanserad temperaturgradient; iii) användare kräver ytterligare utbildning, till exempel hantering av flytande kväve, frysning-EM Cryo galler, lågdos drift, mätning dos, hantering laddningen, drifting och kunskap inom bildbehandling procEssing; iv) brist på repeterbar avbildning för samma Cryo-exemplar under olika TEM sessioner. Cryo-EM exemplar kan lätt skadas av is kontamination under prov lastning och lossning till / från TEM instrumentet. Denna skada är särskilt ett problem när proverna är svåra att isoleras / renas 14; v) små proteiner (<200 kDa molekylmassa) är utmanande att avbildas på grund av låg kontrast; vi) låg kontrast och hög buller-EM Cryo bilder minskar korskorrelationsvärde mellan bilderna, därför minskar totala noggrannheten vid bestämning av protein inriktningar, konformationer och klassifikationer, särskilt för proteiner som är strukturellt flexibla och naturligt varierar i lösning 4,5.
Negativ färgning (NS) är en relativt "gamla" och historisk metod som alla laboratorier, med någon typ EM, kan använda för att undersöka proteinstruktur. Brenner och Horne först utvecklat konceptet of negativ färgning ett halvt sekel sedan för att pröva virus 15. NS åstadkommes genom beläggning av provet med laddade tungmetallsalter. Detta koncept ursprungligen kommer från ljusmikroskop och bruket att bädda bakterier i en färglösning som ger mörkret omkring proverna, vilket gör att högre bildkontrast när du visar den negativa bild 16. Eftersom de tunga metalljoner har en större förmåga att skingra elektroner jämfört med mindre täta atomer i proteinerna 17-20 och beläggning heavy metal fläck tillåter en högre dos begränsning med förbättrad kontrast. NS provet kan ge bilder med hög kontrast 8 för enklare partikelorienteringsbestämning och 3D-rekonstruktion än bilder från Cryo-EM.
Traditionella NS tyvärr kan producera artefakter inducerade av bets-proteininteraktioner, såsom generell aggregering, molekylär dissociation, avskaffande och stapling 8,21,22. För lipid relaterade proteins, såsom lipoproteiner 16,23-30, en gemensam artefakt leder partiklar som är staplade och packade ihop till en rouleaux (Figur 1) 31-36. Många lipoproteiner studier, till exempel nondenaturing polyakrylamid gradientgelelektrofores, studerar Cryo-EM 13,29,37-40, masspektrometri 39,41, och små vinkel röntgendiffraktionsdata uppgifter 42 alla show lipoproteinpartiklar är isolerade partiklar i stället för naturligt staplade tillsammans bildar en rouleaux 21,29,30,35,42-45. Observationen av rouleaux bildning med konventionella NS är eventuellt orsakats av dynamiska interaktioner mellan lipoproteiner består av apolipoproteiner (apo) och fosfolipider som är strukturellt flexibel lösning 13,29,30,46-49 och känslighet för standarden NS-protokollet. För att identifiera denna artefakt, var apolipoprotein E4 (apoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) high-density lipoprotein (HDL) prov som används som ett testprov och cryo-EM bilder för en artefakt fri standard 29, screening NS exemplar framställda i en rad villkor. Genom att jämföra partikelstorlekar och former erhållna från NS och Cryo-EM, var den specifika typ av färgning reagens och saltkoncentrationen befanns vara två nyckelparametrar som orsakar de välkända rouleaux fenomen. Sålunda erhölls en optimerad negativ färgning (OpNS) protokollet rapporterats.
Genom OpNS ades den välkända rouleaux fenomenet apoE4 HDL elimineras genom OpNS (Figur 2A). Statistisk analys visade OpNS ger mycket liknande bilder (färre än 5% avvikelse) i storlek och form jämfört med de från Cryo-EM, var dock kontrasten elimineras. De valideringar av OpNS utfördes genom att undersöka eliminering av rouleaux artefakt av nästan alla klasser eller underklasser av lipoprotein prover 6,29,30,50,51, inklusive apoA-I 7,8 nm (Figur 2B), 8,4 nm (figur 2C) , 9,6 nm discoidal rekonstituerad HDL (rHDL) (Figur 2D), 9,3 nm sfäriska rHDL (Figur 2E), plasma HDL (Figur 2F), lipid fri apoA-I (figur 2G), plasma-HDL (Figur 2H), low density lipoprotein (LDL ) (Figur 2I), intermediär-density lipoprotein (IDL) (Figur 2J), mycket låg densitet lipoprotein (VLDL) (Figur 2K) och POPC liposomer (Figur 2L) 30. Ytterligare validering utfördes genom att avbilda små och asymmetriska proteiner, inklusive den 53 kDa kolesterylester-transferprotein (CETP) (fig 3A – C) 6,29, och mycket flexibelt 160 kDa IgG-antikropp (Figur 4A och B) 4,5,29 , 52, samt två strukturellt väl kända proteiner, GroEL och proteasom (Figur 2 M och N). För att kräva någon ytterligare validering från colleagues, vi är öppna för eventuella blindtester på denna OpNS metoden.
OpNS som en hög genomströmning protokollet har också använts för att studera proteinmekanism genom att granska hundratals prover av små proteiner, såsom CETP som binder till olika proteiner inom en serie villkor (inklusive CETP samverka till 4 klasser av lipoproteiner, modifierat HDL, plasma HDL, LDL och VLDL, med / utan två antikroppar, H300 och N13, under 9 inkuberingstider, inklusive 3 min, 20 min, 1 timme, 2 timmar, 4 timmar, 8 timmar, 24 timmar, 48 timmar och 72 timmar, under 4 molförhållanden, dvs 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, och 3 utspädningar, dvs 0,1 mg / ml, 0,01 mg / ml och 0.001 mg / ml, plus ytterligare stickprovskontroller, bland annat CETP ensam, LDL ensam och VLDL ensam, med tredubbla tester av ovanstående experiment av olika personer) 6,29. OpNS bilder av CETP tillhandahålls höga bilder kontrast med någorlunda fina strukturella detaljer; tillåter oss att framgångsrikt rekonstruera en 3D-täthet karta över de 53 kDa small protein CETP (Figur 3D – F) genom en enda partikel återuppbyggnad. Dessutom hög kontrast OpNS bilder ger oss en tillräcklig signal från ett enskilt protein (Figur 4A – C), som tillät oss att nå mellan upplösning (~ 1,5 nm) i en enda (ett objekt, utan i genomsnitt) IgG-antikropp 3D-struktur via enskilda partiklar elektron tomografi (IPET) metoden (Figur 4E – J) 5. Den detaljerade beskrivningen av IPET återuppbyggnadsstrategi, metodik, steg-för-steg-processer och strukturvariation analys redovisades tidigare 4. En film om IPET antikroppsrekonstruktionsförfaranden, inklusive rå bilder och delresultat, 3D-densitetskartan och struktur dockning fanns också tillgänglig för allmänheten genom att laddas upp till YouTube 5. Jämförelse av 3D-rekonstruktioner från olika enskilda partiklar antikropps kunde avslöja proteindynamik och conformational förändringar under kemiska reaktioner 4,5.
Med tanke på att över 50% av proteiner har molekylmassa som sträcker sig från 40 till 200 kDa 1,2, framgång i att avbilda dessa små proteiner framgår att OpNS metoden är ett användbart verktyg för att driva den konventionella EM gränsen mot små och asymmetriska strukturbestämningar och mekanism upptäckter . Således är den detaljerade protokoll tillhandahålls som nedan.
Jämfört med konventionella NS tekniker, kan OpNS förhindra rouleaux artefakter (Figur 1 och 9), som innehåller tillförlitlig och rimligt hög upplösning (~ 1 nm) strukturella detaljer i små proteiner (Figur 2). Jämfört med Cryo-EM tillhandahåller OpNS en hög genomströmning metod och kan behandla ett stort antal olika proteiner och protein-proteininteraktioner 6. Men fortfarande har OpNS sina nackdelar. Jämfört med konventionella NS, OpNS innebär: i) mer komplicerade steg i extraktion; ii) användning av ett radioaktivt ämne, UF; iii) hålla fläcken fräsch på grund av den kortare styrkan av UF fläcken på grund av dess ljuskänslighet; iv) för att förhindra utfällning av UF Lösningen måste förvaras i -80 ° C och kräver upptining före användning; v) och slutligen alla UF måste hanteras som farligt avfall. Jämfört med Cryo-EM, OpNS ger relativt lägre upplösning och ingen garanti för någon ännu inte upptäckt artefakti framtiden.
NS drift processuella effekter på lipoprotein rouleaux bildning
NS protokoll för beredning av proteiner för undersökning 16,29-36,55 kan delas in i tre huvudgrupper av metoder 50: blanda 55, drop-by-drop 16, och tvättningsprocedurer 29. i) Blandnings protokollet kräver den preliminära blandning av fläcken och proteinprov vid ett specifikt förhållande, och sedan tillämpa den blandade lösningen på klimatfilm belagd på ett rutnät, äntligen ta bort överflödig lösning med filterpapper innan lufttorkning för EM undersökning 55. ii) drop-by-drop-protokollet innebär att tillämpa (~ 4 l) provfall direkt till en EM rutnät belagd i kolfiber låta sitta för ~ 1 min, därefter avlägsna överskottsprovlösning före applicering av en droppe (~ 4 l) av fläcken lösning på samma sida av nätet. Efter ~ 1 min av inkubation, ta bort excess fläcken genom kontakt med rent filterpapper, äntligen lämna in för lufttorkning 16,56-58. iii) Tvätt protokollet (Figur 7) som kräver provlösning ansökan till en EM galler belagda i kol under 1 min, därefter tvättning med avjoniserat vatten tre gånger direkt efter avlägsnande av överskott av lösning varje gång av filterpapper 3,29,30. OpNS protokollet ändrades från denna tvättproceduren.
NS fläcktyper och effekter på lipoprotein rouleaux bildning
I NS, starkare elektron spridning på grund av tungmetall fläckar ger kontrast från proteinerna 17-20,59. NS prover kan dessutom drabbas av högre stråldoser, och förbättra proteinfunktioner med en skarpare negativ kontrast 8,9,60. Fläckar av tungmetaller kan klassificeras som: anjoniska, inklusive fosforvolframsyra (PTA) 16, metylamin volframat 14 och kiseltungstate 61; och katjonic, såsom uranylacetat (UA) 62, UF 3,29,30 och Uranylnitrat (FN) 63. En av de anjoniska NS fläckar som oftast används är PTA 33,64-67. PTA är en heteropolysyra, som normalt används runt en pH 7,0-7,5. PTA kan också användas för positiv färgning 3,16,68. De negativa laddningar av PTA kan förmedla elektrostatiska interaktioner med omättade lipider positivt laddade huvudgrupper, som POPC, på båda lipoprotein och liposom- ytor. PTA kan orsaka rouleaux bildning genom denna interaktion 29,30 även under vanliga buffert salthalt 29,30 (figur 1). AUC fläckar, såsom UA, UF och FN finns alternativa val för katjoniska tungmetaller fläckar och UA särskilt ofta används för NS av en mängd olika biologiska prover 62,69,70. Experiment hittade UF orsakar ingen rouleaux av lipoproteiner som innehåller omättade fett sura lipider, såsom POPC. Dock kan UF fortfarande framkalla rouleaux formation på lipoprotein som innehåller mättade fettsyra lipider, såsom dimyristoylfosfatidylkolin (DMPC) och 1-hexadekanoyl-2-oktadekanoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (PSPC). Den detaljerade mekanismen för denna interaktion är okänd. UA / UF / FN kan alla arbeta vid lägre pH-värden som sträcker sig från 3,5 till 4,6. Sådana lägre pH-värden kanske inte lämpar sig för vissa biologiska makromolekyler som är känsliga för pH 14,71. Intressant nog kan UA / UF fixa proteinstruktur inom några millisekunder genom en okänd mekanism 72. Till skillnad från PTA är UA / UF mer liknar ett salt än en syra.
UF uppgift kan ge bättre resultat än UA 73, där, UF och FN fläckar har mindre kornstorlekar än UA (UF: 0,3 nm, FN: ~ 0.5 nm) 3,74. Ett intressant exempel sekundära strukturlika detaljer i ett litet protein (53 kDa CETP) direkt kan visualiseras från rå micrographs när UF användes som negativ-fläck reagens genom att följatidigare rapporterat Cryo-positiv-färgning (kryo-PS) metoden (Figur 8) 6. I Cryo-PS, det färgade provet flash frysas genom att följa Cryo-EM provberedning förfarande istället för torkningsförfarande i OpNS-protokollet, vilket kan leda till sekundära strukturella kollaps. Den kryo-PS är en metod för hög kontrast och hög upplösning avbildning av små proteiner 75. Eftersom kryo-PS bilder har vänt kontrast jämfört med de från den rapporterade Cryo-NS-protokoll 22, men har konsekvent bild kontrast till de konventionella Cryo-EM bilder, så det fick namnet Cryo-PS metoden. De Cryo-PS bilder visar att färgningsreagens, AUC formiat, tränger den molekylära ytan, utmanar den konventionella uppfattningen att färgning kan visualisera bara den yttre ytstruktur. Mekanismen för hur AUC formiat penetrerar den molekylära ytan är okänd. En möjlighet är att den AUC katjon binder tillgängliga protein karboxylgrupper, och sålundaomgivande glaskroppen is har lägre densitet än färgning av protein och AUC grupper, och därmed utgöra en positiv fläck. Cryo-PS-metoden liknar isomorf ersättning (MIR) metoden med flera, som var en gemensam strategi för att lösa problemet fas i röntgenkristallografi 76-78. I MIR, är kristallprover indränkt med en tung atom-lösning, inklusive uran, för att få en isomorf form dess naturliga form. Tillägget av den tunga atomen ibland inte påverkar kristallbildning eller enhetscelldimensioner, men ger ytterligare information om kristallstrukturbestämning 76-78. Genom att dra nytta av den lilla korn av UF, kunde kryo-PS ger en hög kontrast och högupplöst bild av ett enda protein, vilket är viktigt för proteinstrukturen studier, särskilt med tanke på att nästan alla proteiner är naturligt dynamiska och heterogena i lösning. För validering av denna Cryo-PS-metoden, öppnar vi för några blindtest från EM fältet. </p>
Saltkoncentration effekter på rouleaux bildning i lipoproteiner
Använda normal PTA negativ färgning reagens, observeras rouleaux bildning mer sannolikt relaterade till lipid interaktioner istället för proteininteraktioner. Avbildning av prover av POPC liposomvesiklar framställda under betydande salthalt (0,5 M NaCl), måttlig salthalt (0,25 M NaCl), relativt svag salthalt (0,1 M NaCl), och rent vatten (Figur 9), de elektronmikro visar rouleaux bildningen var korrelerad till saltkoncentration (figur 9A – D). Använda UF som negativ färgning reagens ades ingen rouleaux observerats i POPC liposomvesikel prov 30 (figur 2 liter), vilket tyder på tvättproceduren för att snabbt sänka saltkoncentrationen precis innan färgningen är ett nödvändigt, men inte tillräckligt självständigt steg för att förhindra rouleaux i POPC relaterat prover.
<p class="Jove_content"> TEM imaging litet protein kräver en nära-Scherzer fokustillstånd.Framgångsrik TEM avbildning av små proteiner med högre upplösning kräver två kritiska förhållanden, en riktig ljushöjden och en nära-Scherzer fokus förvärvs skick. i) En riktig ljushöjden kan bedömas genom antalet synliga Thon ringar (effektspektrum) på Fourier överföring av en kol filmbild förvärvats enligt en relativt hög minskad fokus. Ju bättre uppriktningstillståndet av balken, desto fler Thon ringarna visualiseras och mätbara .. ii) förvärva bilden under en nära-Scherzer fokus är ett annat kritiskt tillstånd. En traditionell standardstrategi för avbildning av biologiska prover använder vanligtvis hög defocus (1-2 pm och ännu mer), vilket kan öka det biologiska provet bildens kontrast 79. Denna strategi är väsentlig skiljer sig från den typiska strategi för avbildning atomär upplösning struktur av hårda material, som oftautnyttjar en nära Scherzer fokus (~ 50 nm minskad fokus). Även kan en högre minskad fokus stärka biologiskt prov skulle däremot högupplösta signaler delvis elimineras. Som ett resultat, skulle medverkan av högupplösta signalen vara lägre vid en högre minskad fokus imaging skick. Anledningen är att, TEM bild är faltningen av provstruktur och instrumentets CTF. CTF är en oscillerande kurva mot frekvensen, där kurvan ofta oscilleras korsar noll amplitud vid hög frekvens. Varje gång när CTF över noll, provet strukturella signalen vid denna specifika frekvens kommer att avskaffas (noll gånger varje nummer kommer att vara noll). Den eliminerade signalen vid denna frekvens kan aldrig återvinnas av någon CTF korrigeringsalgoritm (en nolla delat med en nolla kan vara något slumpnummer i stället för den ursprungliga struktursignalen). Under högre defocus imaging kommer CTF oscillera mycket mer aggressivt, sålunda CTF korsar noll amplitud oftare, såsom ett resultat,de strukturella signalerna vid ett större antal specifika frekvenser kommer att försvinna. Ju fler signaler som elimineras, desto mindre medhjälp bilden kommer att ha. Noterbart kan medverkan av bilden inte åter eller korrigeras av någon CTF korrigering. Dock kan ett antal Felaktiga bilder som förvärvats under olika suddig användas för att fylla sina luckor till varandra för att fått en klar strukturell signal av provstrukturen via en medelvärdesmetod, där till och med en atomär upplösning kan uppnås 9-12.
Medelvärdesmetoden är en kraftfull metod för att uppnå struktur vissa mycket symmetriska proteiner och strukturellt relaterade stela proteiner. Men, det är fortfarande en utmaning i det strukturella studier av små och asymmetriska proteiner, särskilt för strukturdynamik och flexibla proteiner, till exempel antikroppar och HDL. Medelvärdes baseras på antagandet att proteinpartiklar är identiska i struktur och konformation men different i oriente, är dock många proteiner kända för att undergå termodynamiska fluktuationer i lösning. Genom att tillämpa medelvärdesmetoden utan att först känna till proteintermodynamiska fluktuation svängningar, kan den genomsnittliga strukturen orsakar ofta saknas domäner 10,80 eller lokal variation i upplösning 81 in-EM Cryo rekonstruktioner.
Framgången för att uppnå 3D-rekonstruktion av litet protein, som 53 kDa CETP, och 3D-strukturen av ett enda protein, såsom 160 kDa IgG1 antikropp, fördelar med att använda en nära-Scherzer fokus imaging tillstånd under ett korrekt inriktning skick. Även bildkontrasten förefaller lågt i nära-Scherzer fokusbilder, kan kontrasten lätt förbättras genom att helt enkelt applicera en lågpass-filtrering för att reducera högfrekvent brus i bakgrunden. Vi tror, en nära-Scherzer fokusera bilder att motsvara de största strukturella signaler, och kan öka noggrannheten i partikel inriktning och öka effektivitet i enkel-partikel 3D-rekonstruktion och individuell partikel elektron tomografi rekonstruktion.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Mickey Yang för redigering och kommentarer, och Drs. Lei Zhang och Bo Peng för hjälp. Detta arbete stöddes av Office of Science, Office of Basic Energivetenskaper av Förenta staternas Department of Energy (avtal nr. DE-AC02-05CH11231), National Heart, Lung, och Blood Institute of National Institutes of Health (no . R01HL115153) och National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health (nr. R01GM104427).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Stain: Uranyl Formate | The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc. | 02545-AA | http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml |
SYRINGE: 1ML NORM-JECT | VWR | 89174-491 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491 |
Syringe filter: 0.2 μm | VWR | 28145-487 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487 |
Syringe filter: 0.02 μm filter (Anotop 10) | Whatman | 6809-1002 | http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-Aldrich | D8537 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en®ion=US |
Parafilm: 4 in. x 125 ft. | VWR | 470152-246 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A |
Carbon film coated TEM grid: 300 mesh | Pacific Grid-Tech | Cu-300CN | http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon |
Carbon film coated TEM grid: 200 mesh | EMS (Electro Microscopy Sciences) | CF200-Cu | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx |
Tweezer: Dumont Tweezer L5 | EMS (Electro Microscopy Sciences) | 72882-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5 |
Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System | EMD Millipore | Milli-Q Advantage A10 | http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117 |
Filter Paper: Grade 1 circles | Whatman | 1001-090 | http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx |
Aluminum Foil | NA | NA | Any type |
Glow Discharge Unit | Ted Pella | 91000 | http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm |
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10µL Pipettors | VWR | 89174-520 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520 |
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40µL Pipettors | VWR | 89174-524 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524 |
Filter Tips: VWR Signature 200 µL Pipet Tips | VWR | 37001-528 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528 |
Pipet | Pipetman | F161201 and F167300 | http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx |