最適化された負の染色：電子顕微鏡による小型·非対称蛋白質構造を調べるためのハイスループットプロトコル

のOPNの実装は、以下のようなさまざまなリポタンパク質の種の構造的および形態学的検査が含まれる：発生期の組換えHDL（のrHDL）、球状組換えHDL、血漿HDL、LDL、IDLおよびVLDL（図2）30;そのような53kDaのCETP（首尾EMを通して画像最小のタンパク質の中で）（図3）6と160kDaのIgG抗体などだけでなく、小さなタンパク質（最もダイナミックで異質タンパク質の一つ）（図4）4,5,29,52でも28kDaの脂質無料アポリポタンパク質A-1（図2L）、およびGroELおよびプロテアソーム（図2MおよびN）。 ハイスループット法としてのOPNの他の例は、53 kDaのCETPように、タンパク質のメカニズムの解明のためのタンパク質 – タンパク質相互作用を検討している。冒頭で述べたように、CETPは、リポタンパク質の異なるサブクラスとどのように相互作用するかinvestigaだったテッドは私たちの知る限り、400以上のEM標本6を調べる経由で、スクリーニングに約100の異なる条件を必要とする低温電子顕微鏡研究のような場合はありませんでした。 のOPNは小さく、非対称のタンパク質立体構造を研究し、さらには3D構造が（平均化せずに）単一および個別のタンパク質を形成達成するために拡大して、EMの境界を拡張することができます。例えば、IgG抗体は、中間解像度で3D再構成を達成することが挑戦された非常に柔軟な構造を有する160kDaの分子である。のOPN方法は、チルト角（図4EおよびH）の一連の画像を個別のIgG抗体を使用した。 4,5 -個別の粒子の電子断層撮影（IPET）（J図4E）によって単一のタンパク質を正常に再構築のために許可されたのOPNから合理的に高解像度と高コントラストタンパクイメージ。 IPET 3D再構成では、 <su対象とする抗体のページ> 4、2Dチルトシリーズは次第に〜14.1Å（図4FおよびG）4の解像度で3D密度を達成するために、その後、逐次近似再構成を経由して、その算出したグローバルセンターに整列させた。同じアプローチでは、単一の抗体-ペプチド複合体を再構築した、そして単一の抗体粒子の内部ドメインのコンフォメーション変化を誘導したペプチド（図4IとJ、解像度〜16.6Å）4,5発見されました。異なる個別の粒子からの3D再構成を比較すると、構造解析は、私たちは、タンパク質の熱力学的な変動を明らかにすることを可能にし、さらに化学反応4,5,29,53,54の中間段階を「スナップショット」。 要約すると、40kDaの間の分子量を有するタンパク質 – 200 kDaのは、標準的なEM構造的な検査や再構成のために挑戦しています。考慮すると、50％を超えること40からの範囲の分子量があるタンパク質- 200 kDaの1,2、私たちは小さな非対称構造決定、さらには機構研究に向けて、従来のEM境界をプッシュする、堅牢かつ高スループットのツールとしてのOPN方法を報告している。 従来のネガティブ染色（NS）、EMによるリポタンパク質の1ルーローアーティファクト図 。 （パネル下）電子（パネル上）の顕微鏡写真と選択された粒子は、標準的なミックス手続きの下でリンタングステン酸（PTA）とNSの後に連銭と、各種リポタンパク質を示しています。のApoE4を持つ（A）再構成HDL（のrHDL）、（B）はアポA-I含有9.6 nmの円板状のrHDL、（C）は、血漿LDL、（D）非アポリポタンパク質含有POPCリポソームを含むアポ。バー：50nmである。ウィンドウのサイズ：AとC、20 NM; Bは30nm。脂質研究のジャーナルが最初にこの作品29,30を発表した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 最適化されたネガティブ染色（のOPN）EMによる図2。タンパク質構造の電子顕微鏡写真のOPNによって連銭アーティファクトなしに、さまざまなリポタンパク質およびリポソームを示し、（A）アポE4含有のrHDL;（B）7.8ナノメートルのrHDL（C）8.4ナノメートルのrHDL;（ D）9.6ナノメートルのrHDL（E）9.3 nmの球状のrHDL;（F）ヒト血漿α-HDL、（G）、血漿HDL;（H）ヒト血漿LDL、（i）ヒト血漿IDL;（J）ヒト血漿VLDL; <stroNG>（K）のPOPCリポソーム;（L）脂質自由アポA-I。追加の検証は（M）GroELおよび（N）プロテアソームサンプルを用いて行った。顕微鏡写真（上のパネル）および（パネル下）選択された粒子。バー：50nmである。ウィンドウのサイズ： – Dは20nm; EとF、25ナノメートル; G、20ナノメートル; H、25nmの; I、50ナノメートル; JおよびKは100nm; L、80nmで。、脂質自由アポA-I、GroELおよびプロテアソームを除いて、本研究は、もともと脂質研究29,30のジャーナルに掲載されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図CETPの3のOPN電子顕微鏡写真。 （A）CETP（破線の円）との概要顕微鏡写真バナナ形状の粒子。（B）Windowe生の粒子を選択dは。明らかに他の小型·軽量化と、より狭い先端（左パネル）を含め大きく、重く、大きな球状の先端を示す（C）三つの生のCETP粒子画像、少ない全体的な曲率を有する類似した末端領域を示す上面図（中央CETP（右パネル）の長軸を上下のパネル）、およびエンドビュー（D）結晶構造（PDB重ね。これらの原料CETPの粒子画像に2OBD）は、とすることができる方位を示す両方の構造形状及びドメインサイズでよく一致するほぼ直接類似度（相互相関計算を計算する（ アブイニシオプロセスを自由2Dクラス平均を参照コンピュータ（（C）にパネルを対応する）。（E）であっても援助なしで定義された）これらのランダムに配向された粒子の、粒子を有する互いに高い類似性は、グループ化された整列した後、バックグラウンドノイズを低減するために平均化し、粒子画像詐欺を強化したtrast。参照の無料の2Dクラス平均は、ない任意のヒト作ら初期モデルは、このクラスの平均値に関与されたEMANパッケージにrefine2D.pyソフトウェアによって計算されます。参照クラスの平均）は、単一粒子の再構成からの3D再構成を検証するための独立した方法として使用することができる。（F）選択基準フリー2Dクラスの平均が他に比べてより大きな遠位端を示す。（G）スーパーインポーズ結晶構造（PDB ：、オーバーレイ画像は、構造の形状やドメインサイズ（低いパネル）の両方で結晶構造とリファレンスのないクラスの平均と近くの一致を参照自由の平均値に2OBD）の比較を示した（F）でCETPの3次元密度マップ。 13オングストロームの分解能は、のOPNおよび単一粒子再構成法（上部パネル）および結晶構造（低いパネル）によるこの単一粒子の再構成にドッキング隆起体によって撮像された粒子8,879から再構成した。 DET画像前処理、初期モデル、精密化手順、角度分布とフーリエシェル相関（FSC）を含む単一粒子再構成のailed情報は、方法の項に出版された原著論文の補足情報（H）単一粒子の再構築の最終比較（パネル上）と追加のPDBフィット比較（下のパネル）6。バー：A、50ナノメートル; B – Dは10nm; F、3nmで。これらの図の一部は、以前にネイチャーケミカルバイオロジー6に掲載されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図4のOPN画像およびヒトIgG 1抗体粒子の再構成。 （A）以上ヒトIgG1抗体のOPN画像の表示。粒子は、3のサブドメインを有する粒子を表示明確に白丸で示す。（B）手動で生粒子のエッジを周囲雑音を低減して高解像度の5個体非結合抗体の粒子の原画像および（C）それらの対応するノイズ低減画像を選択（タッチなし簡単に可視化するための粒子内部の密度）。（D）と同様にEM画像を表示するに配向されたIgG1抗体の結晶構造（PDBエントリー1IGT）。対応する画像の比較は、EM画像およびドメインの位置と形状を含む結晶構造、間に多くの共通の特徴を示している。（E）単一インスタンスIgG1抗体からの第一原理 3D再構成のステップ·ツーステップ手順（なし平均、一つの個別オブジェクト）の個別粒子電子断層撮影（IPET）メソッドを使用して、（F）シ最終的な3D再構成14.1オングストロームの分解能でngle抗体粒子が「Y」字状に形成する3つのドーナツ状の領域を示した。（G）は、それぞれのドメイン密度マップの対応するそれぞれにドメインの結晶構造をドッキングし、手動でドメイン間のループを繰り返す。（H）と IPETによる単一のIgG-ペプチド複合体（なし平均、一人の個人のオブジェクト）の3次元再構成のステップ·ツーステップ手順（I）のIgGペプチド複合体の最終的な3D再構成は、16.6オングストロームの分解能で表示されていた3ロッドを示した「Y」字状に形成する形のドメイン（J）は、それぞれ、各IgG抗体ドメインの結晶構造（PDBエントリー：1IGT）をドッキング。各棒状密度には不十分インナードメイン構造変化を示唆して、ドメインの結晶構造とのマッチングが示されたペプチド結合の後。詳細な手順は、解像度解析と統計は、元の論文に記載された<s> 5バーアップ：A、50ナノメートル; B – Dは10nm。この作品は、最初はPLoSのONE 4に掲載さと科学の5を報告します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ツァイスリブラ120のLaB 6 TEMにより1.6μmのデフォーカス下で撮像されたアモルファスカーボン膜の図5パワースペクトル。高解像度イメージングは、EMが適切な位置合わせと高解像度能力を有することを示す十分な証拠を必要とする。グリッド上の近く炭素領域のパワースペクトルの解析は、従来のデータ収集に対するビームのコヒーレンス状態を確認する効率的な方法である。アモルファスカーボン領域の画像のフーリエ変換は、機器関連のコントラスト伝達関数（Cを示す TF）は、そのようにトーンリングと呼ばれる。適切な位置合わせおよびコヒーレンスは、可視トーンリング、比較的高いデフォーカス条件で可視のトーンリングの最高解像度の数によって反映させることができる。 TEM装備のLaB 6フィラメントの近くで適切な位置合わせ条件の一例として、以上〜20以上のトーンリング（〜5Å）炭素膜から生成することができ、用量20.4電子使用してデフォーカスが1.6μmで画像化されている- /Å2。ローエンドTEMから達成トーンリングは、適切な配向状態で運転電界放出銃（FEG）強化TEMとして、ハイエンドのTEMからと類似している。当初は科学的に発表され、この作品は、5を報告します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 6highres.jpg "幅=" 500 "/> のOPNイメージングのための「理想的な」領域の図6の例の顕微鏡写真。つのタンパク質サンプル（A）のGroEL（B）プロテアソーム（C）球状HDLは、イメージングのための理想のOPNを実証する例として使用した。汚れが偏在検体中に分布しているので、サンプルの低倍率は、通常、「曇った」（一番左のパネル）が表示されます。イメージングのための理想的な領域は、通常、これらの「雲」の境界に位置しています。ステップ·バイ·ステップズームインつの「曇った」染色領域（左中パネル）の例は、高倍率画像は、高解像度および粒子の高コントラスト画像（右中パネル）を呈する示す。粒子の選択された画像は、タンパク質の構造の詳細（一番右のパネル）を示す。バー：30nmで大型を見るにはこちらをクリックしてください。この図のRのバージョン。 図7のOPN手順の概略図。 （A）EMグリッド培養ステーション、グロー放電したグリッド上に試料溶液をインキュベートするための簡単なステーション。光に染み曝露を最小限に抑えながら、氷床上記水洗水滴、汚れの液滴を維持するように設計（B）染色ワークステーション。 （C）染色手順の概要を示す：ブロッティング方向、3回水洗、3×UF染色露光、染色液滴上の反転サンプルグリッド染色インキュベーション、および最終裏面サンプルはによって乾燥前にサンプル染色溶液の薄層を確保するためにブロッティング窒素、空気。 番目の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図である。 図8ハイ- 53kDaの小さなタンパク質CETPの解像度の画像は、修正のOPN法、クライオ陽性染色（クライオ-PS）から明らかになったファイブを高解像度かつ円形状（逆コントラスト）CETP粒子のソフトマスクされたRAW画像を選択します。および粒子形状を容易に可視化するための原料粒子（原料粒子画像」エッジを囲む手動でノイズ低減が、粒子内の任意の濃度を変更せず）をマスクする。すべての原子とEM画像に各粒子の同様の向きに揃え生粒子をマスキングするためのリボン結晶構造の比較。すべての結晶構造の特徴は、生データから解決することができるが、生の画像領域の高解像度の詳細は、結晶構造を有する一定の類似性を表示する。 Remarka BLY、これらのRAW画像は、両末端での類似性は、手動で縮小ノイズ画像（三角形）で見られ、近くに小さな円形の穴を有する終了示し;また、粒子画像内のC末端領域における鎖は結晶構造を補完βシート（矢印）、そして最後に、CETP C末端領域上の突出ループが結晶構造（菱形）でに似ている。（A）五セレクト（逆コントラスト）CETP粒子の高分解能及び円形ソフトマスクされた生の画像（B）10aにフィルタリングするローパス。（C）20aにフィルタリング高いローパス。（D）を手動でノイズ低減画像をマスクされた。（E）リボン構造による結晶構造比較。すべての原子表現による（F）結晶構造の比較。バー：5nmの。この作品の一部はネイチャーケミカルバイオロジー6に掲載されました。痩せ細っ ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図9塩分が異なるの下で、従来のNSプロトコル（PTA染色）により連銭形成を示すリポソームの電子顕微鏡写真。 （A）高塩分（〜0.5 MNaCl）。（B）正規塩分（〜0.25のNaCl）。（C）低塩分（〜0.1MのNaCl）。（D）純粋な水。顕微鏡写真（パネル上）と示した（パネルの下）を選択し、ウィンドウの粒子。バー：100nmである。ウィンドウのサイズ：80 nmの。脂質研究のジャーナルは、もともとこのワーク30を発表した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。