Mere end halvdelen af proteiner er små proteiner (molekylvægt <200 kDa), der er udfordrende for både elektronmikroskop billedbehandling og tredimensionale rekonstruktioner. Optimeret negativ farvning er en robust og high-throughput-protokollen til at opnå en høj kontrast og relativt høj opløsning (~ 1 nm) billeder af små asymmetriske proteiner eller komplekser under forskellige fysiologiske betingelser.
Strukturel bestemmelse af proteiner er ret udfordrende for proteiner med molekylvægte mellem 40 til 200 kDa. I betragtning af at mere end halvdelen af naturlige proteiner har en molekylmasse mellem 40-200 kDa 1,2, er der behov for en robust og high-throughput metode med en nanometer opløsning kapacitet. Negativ farvning (NS) elektronmikroskopi (EM) er en nem, hurtig og kvalitativ tilgang, som der ofte er blevet brugt i forskningslaboratorier til at undersøge protein struktur og protein-protein interaktioner. Desværre konventionelle NS protokoller ofte genererer strukturelle artefakter på proteiner, især lipoproteiner, der normalt danner præsentere Rouleaux artefakter. Ved at bruge billeder af lipoproteiner fra cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) som en standard, blev de centrale parametre i NS prøvepræparation betingelser nylig screenet og rapporteres som den optimerede NS-protokollen (OpNS), en modificeret konventionel NS protokol 3. Artefakter som rouleaux kan blive kraftigt begrænset af OpNS, derudover giver høj kontrast sammen med rimelig høj opløsning (nær 1 nm) billeder af små og asymmetriske proteiner. Disse høj opløsning og høj kontrast billeder er også gunstige for en enkelt protein (et enkelt objekt, ingen gennemsnit) 3D-rekonstruktion, såsom en 160 kDa-antistof via den elektron tomografi 4,5. Desuden kan OpNS være en høj-throughput værktøj til at undersøge hundredvis af prøver af små proteiner. For eksempel den tidligere publicerede mekanisme 53 kDa cholesterylesteroverførselsprotein (CETP) involverede screening og billeddannelse af hundredvis af prøver 6. I betragtning af cryo-EM sjældent held billeder proteiner mindre end 200 kDa har endnu at offentliggøre enhver undersøgelse, der involverer screening over hundrede betingelser prøve, er det rimeligt at kalde OpNS en high-throughput metode til at studere små proteiner. Forhåbentlig OpNS protokol præsenteres her kan være et nyttigt redskab til at skubbe grænserne for EM og fremskynde EM undersøgelser af lille protein struktur, dynamik og mekanismer.
Forståelse protein funktion kræver viden om proteiners struktur. Strukturel bestemmelse er udfordrende for proteiner, hvis molekylmasser er inden for 40 til 200 kDa. Røntgenkrystallografi er begrænset af proteinkrystallisation; kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi er begrænset til molekylmasser mindre end 40 kDa, mens kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har svært ved både køb billede og tredimensionale (3D) rekonstruktioner af små proteiner, som molekylære masser er mindre end 200 kDa. Især mere end 50% protein har en molekylmasse i intervallet 40 til 200 kDa 1,2, da de nuværende metoder er udfordrende i at studere proteiner af denne størrelse, er der behov for en ny metode.
Selv om de fleste transmission elektronmikroskoper (TEMS) er i stand til atomar opløsning, dvs bedre end 3 en resolution, opnå endnu en nær nanometer opløsning struktur fra et biologiske prøver er temmelig Challenging 7. Stråling skader, lav kontrast, strukturelle afvigelser samt artefakter såsom dehydrering alle hindre høj opløsning TEM billeddannelse 3,8.
Blandt de forskellige TEM metoder, cryo-EM er en avanceret og banebrydende metode til at opnå atomare strukturer af stærkt symmetriske store makromolekyler resolutionen under nær fysiologiske betingelser 9-12. Cryo-EM prøve fremstilles blitz frysning prøveopløsningen, indlejring af makromolekyler i glaslegeme is, som efterfølgende afbildet ved kryogene temperaturer, såsom flydende nitrogen eller helium temperaturer 13. Cryo-EM er fordelagtig ved, at prøverne ikke udgør nogen artefakter og er næsten nativ struktur 8-12. Cryo-EM har sine ulemper: i) yderligere enheder er forpligtet til at blive installeret eller købt til at opgradere en standard TEM instrument til en cryo-EM kapacitet. Enheder omfatter: anti-contaminator, cryo-indehaver, lavdosis-mode software og lavdosis Sensitiv CCD-kamera, selv om priserne på disse enheder er meget lavere end prisen for TEM instrument selv; ii) cryo-EM operation kræver længere tid end NS drift. Behandlingen af en cryo-EM prøven kræver ofte længere tid til at forberede prøver og drive TEM instrument end NS fordi cryo-EM kræver adressering yderligere problemer, herunder: flydende kvælstof temperatur drift, prøve opladning, billedbehandling afdrift, temperaturgradienter, lavdosis model operation, prøve felsomhed og dosering begrænsninger. Disse ekstra skridt vil bremse hastigheden for at erhverve nyttige data i forhold til erhvervelse IF data selv om et par cryo-EM billeder helt kan opnås i 1 time eller derunder ved cryo-EM eksperter med det instrument fremstillet med en afbalanceret temperaturgradient; iii) brugere kræver ekstra uddannelse, såsom håndtering af flydende kvælstof, frysning cryo-EM gitre, lavdosis drift, måling dosis, håndtering opladning, drifting og viden i billedbehandling procEssing; iv) mangel på gentagelig billeddannelse til samme cryo-prøve under forskellige TEM sessioner. Cryo-EM prøver beskadiges let af is kontaminering under prøven lastning og losning til / fra TEM-instrumentet. Denne skade er især en bekymring, når prøverne er vanskelige at isoleres / oprenses 14; v) små proteiner (<200 kDa molekylvægt) er udfordrende at blive afbildet på grund af lav kontrast; vi) lav kontrast og høj støj af cryo-EM billeder reducerer krydskorrelationen værdi mellem billeder, derfor faldende samlede nøjagtighed i bestemmelsen af protein orienteringer, konformationer og klassifikationer, især for proteiner, der strukturelt fleksibel og naturligt svinger i opløsning 4,5.
Negativ farvning (NS) er en relativt "gamle" og historisk metode, som alle laboratorier, med enhver form EM, kan bruge til at undersøge proteiners struktur. Brenner og Horne først udviklet konceptet of negativ farvning et halvt århundrede siden for behandlingen virus 15. NS opnås gennem coating modellen med ladede tungmetalsalte. Dette begreb der oprindeligt kommer fra lysmikroskopi og praksis for indlejring bakterier ind i en plet løsning, der giver mørke omkring prøverne, så højere billedets kontrast, når du ser det negative billede 16. Eftersom tungmetalioner har en større evne til at dispergere elektroner i forhold til mindre tætte atomer i proteinerne 17-20, og coating tungmetal pletten tillader en højere dosis begrænsning med forbedret kontrast. NS prøven kan give billeder med høj kontrast 8 til lettere partikel orientering beslutsomhed og 3D-rekonstruktion end billeder fra cryo-EM.
Traditionelle NS, desværre, kan producere artefakter fremkaldt af bejdse-protein interaktioner, såsom generel sammenlægning, molekylær dissociation, fladere og stabling 8,21,22. For lipid relateret proteins, såsom lipoproteiner 16,23-30, en fælles artefakt resulterer i partikler, der er stablet og pakkes sammen i en pengerulledannelse (figur 1) 31-36. Mange lipoprotein-undersøgelser, såsom denaturerende polyacrylamid gradient gelelektroforese cryo-EM undersøgelser 13,29,37-40, massespektrometri 39,41 og mindre vinkel røntgen-diffraktionsdata 42 alle viser lipoprotein partikler er isolerede partikler i stedet for naturligt stablet tilsammen danner en pengerulledannelse 21,29,30,35,42-45. Observationen af rouleaux dannelse ved konventionelle NS er muligvis forårsaget af dynamiske interaktioner mellem lipoproteiner sammensat af apolipoproteiner (apo) og phospholipider, der strukturelt fleksibel i opløsning 13,29,30,46-49 og følsomhed over for den standard NS-protokollen. For at identificere denne artefakt blev apolipoprotein E4 (apoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) high-density lipoprotein (HDL) prøve, der bruges som en prøve og fryselagringEM billeder til et artefakt gratis standard 29, screening NS prøver udarbejdet under en række betingelser. Ved at sammenligne de partikelstørrelser og former opnået fra NS og kryo-EM blev den specifikke type farvningsreagens og saltkoncentration fundet at være to nøgleparametre forårsager de velkendte Rouleaux fænomener. Således blev en optimeret negativ farvning (OpNS) protokol rapporteret.
Ved OpNS blev den velkendte pengerulledannelse fænomenet apoE4 HDL elimineres ved OpNS (figur 2A). Statistisk analyse viste OpNS udbytter meget ens billeder (færre end 5% afvigelse) i størrelse og form i forhold til dem fra cryo-EM blev dog kontrasten elimineret. De validere OpNS blev udført ved at undersøge fjernelse af pengerulledannelse artefakt af næsten alle klasser eller underklasser af lipoprotein prøver 6,29,30,50,51, herunder ApoA-I 7,8 nm (figur 2B), 8,4 nm (figur 2C) , 9,6 nm discoidal rekonstitueret HDL (rHDL) (figur 2D), 9,3 nm sfæriske rHDL (figur 2E), human plasma-HDL (figur 2F), lipid fri ApoA-I (figur 2G), plasma-HDL (figur 2H), lipoprotein med lav densitet (LDL ) (figur 2I), mellemprodukt-density lipoprotein (IDL) (figur 2J), med meget lav densitet (VLDL) (figur 2K) og POPC liposom (figur 2L) 30. Yderligere valideringer blev udført ved at afbilde små og asymmetriske proteiner, herunder 53 kDa cholesterylesteroverførselsprotein (CETP) (figur 3A – C) 6,29 og meget fleksibel 160 kDa-IgG-antistof (figur 4A og B) 4,5,29 , 52, og to strukturelt velkendte proteiner, GroEL og proteasom (figur 2M og N). For at kræve nogen yderligere validering fra Colleagues, vi er åbne for enhver blindtest på denne OpNS metode.
OpNS som en high-throughput protokol også er blevet brugt til at studere protein-mekanisme via undersøge hundredvis af prøver af små proteiner, såsom CETP, der var bindende for forskellige proteiner henhold til en række betingelser (herunder CETP interagere til 4 klasser af lipoproteiner, rekombineret HDL, plasma-HDL, LDL og VLDL, med / uden 2-antistoffer, H300 og N13, under 9 inkubationstider, herunder 3 min, 20 min, 1 time, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer, under 4 molforhold, dvs 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, og 3 fortyndinger, dvs 0,1 mg / ml, 0,01 mg / ml og 0,001 mg / ml, plus yderligere kontrolprøver, herunder CETP alene, LDL alene, og VLDL alene, med tredobbelt test af ovennævnte eksperimenter af forskellige personer) 6,29. OpNS billeder af CETP forudsat høj kontrast billeder med rimelighed fine strukturelle detaljer; giver os mulighed for at kunne rekonstruere et 3D tæthed kort over 53 kDa SMAll protein CETP (figur 3D – F) ved en enkelt partikel genopbygning. Desuden høj kontrast OpNS billeder giver os en tilstrækkelig signal fra en enkelt protein (figur 4A – C), hvilket tillod os at opnå den mellemliggende opløsning (~ 1,5 nm) i en enkelt (ét objekt, ingen gennemsnit) IgG-antistof 3D struktur via individuel partikel elektron tomografi (Ipet) metode (figur 4E – J) 5. Den detaljerede beskrivelse af Ipet genopbygning strategi, metode, trin-for-trin processer og strukturel variation analyse blev tidligere rapporteret 4. En film om Ipet antistof genopbygning procedurer, herunder de rå billeder og foreløbige resultater, 3D tæthed kort og strukturel docking var også tilgængelig for offentligheden ved uploadet til YouTube 5. Sammenligning af 3D rekonstruktioner fra forskellige individuelle antistofpartikler kunne afsløre protein dynamik og Conformational ændringer under kemiske reaktioner 4,5.
I betragtning af at over 50% af proteiner har molekylmasse spænder fra 40 til 200 kDa 1,2, succes i at afbilde disse små proteiner viste, at OpNS metoden er et nyttigt værktøj til at skubbe den konventionelle EM grænse mod små og asymmetriske strukturelle beslutninger og mekanisme opdagelser . Således er den detaljerede protokol billede nedenfor.
Sammenlignet med konventionelle NS teknikker, kan OpNS forhindre Rouleaux artefakter (figur 1 og 9), der giver pålidelig og rimelig høj opløsning (~ 1 nm) strukturelle detaljer i små proteiner (figur 2). Sammenlignet med kryo-EM OpNS giver en high throughput fremgangsmåde og kan behandle en bred vifte af proteiner og protein-protein interaktioner 6. Men OpNS stadig sine ulemper. Sammenlignet med konventionelle NS, OpNS indebærer: i) mere komplicerede trin i modellen forberedelse; ii) under anvendelse af et radioaktivt stof, UF; iii) holde pletten frisk på grund af den kortere styrken af UF plet på grund af sin lysfølsomhed; iv) for at forhindre udfældning UF Opløsningen skal opbevares i -80 ° C og kræver optøning før brug; v) og til sidst alle UF skal håndteres som farligt affald. Sammenlignet med cryo-EM, OpNS giver relativt lavere opløsning billeder og ingen garanti for nogen endnu ikke opdaget artefakti fremtiden.
NS drift proceduremæssige effekter på lipoprotein rouleaux dannelse
NS-protokoller til at forberede proteiner til undersøgelse 16,29-36,55 kan inddeles i tre hovedgrupper af metoder 50: blanding 55, drop-af-drop 16, og vaskeprocedurer 29. i) blanding protokollen kræver den indledende blanding af pletten og protein prøve på et bestemt forhold, og derefter anvende den blandede opløsning på kulstof belagt på et gitter, endelig at fjerne overskydende opløsning med filtrerpapir før lufttørring til EM undersøgelse 55. ii) drop-by-slip-protokol indebærer anvendelse (~ 4 ul) prøve drop direkte til en EM gitter belagt med kulstof lade sidde i ~ 1 min, derefter fjerne overskydende prøveopløsning før påføring af en dråbe (~ 4 ul) af pletter løsning på den samme side af gitteret. Efter ~ 1 min inkubation, fjern for strams pletten gennem kontakt med ren filtrerpapir endelig indsendelse til lufttørring 16,56-58. iii) vask protokollen (figur 7), der kræver prøveopløsning ansøgning til en EM gitter belagt med kulstof i 1 min, derefter vask med demineraliseret vand tre gange lige efter fjernelse af overskydende opløsning hver gang med filtrerpapir 3,29,30. OpNS protokol blev ændret fra denne vask procedure.
NS plettyper og effekter på lipoprotein rouleaux dannelse
I NS, stærkere elektron spredning på grund af tungmetaller pletter giver kontrast fra proteinerne 17-20,59. NS prøver kan desuden lide større strålingsdoser, og forbedre protein funktioner ved at en skarpere negativ kontrast 8,9,60. Pletter af tungmetaller kan klassificeres som: anioniske, herunder phosphowolframsyre (PTA) 16, methylamin wolframat 14 og silicium tungstate 61; og kationIC, såsom uranylacetat (UA) 62, UF 3,29,30, og uranylnitrat (FN) 63. En af de anioniske NS pletter, der er mest almindeligt anvendte er PTA 33,64-67. PTA er en heteropolysyre, der typisk anvendes omkring pH 7,0-7,5. PTA kan også anvendes til positiv farvning 3,16,68. De negative ladninger på PTA kan mediere elektrostatiske interaktioner med umættede lipider positivt ladede hovedgrupper, ligesom POPC, på begge lipoprotein og liposom overflader. PTA kan forårsage rouleaux-dannelse gennem denne interaktion 29,30 selv under almindelig puffer saltholdighed 29,30 (figur 1). Uranyl pletter, såsom UA, UF og FN er alternative muligheder for kationiske tungmetaller pletter og UA især bruges ofte til NS af en række biologiske prøver 62,69,70. Eksperimenter fundet UF forårsager ingen pengerulledannelse af lipoproteiner, der indeholder umættede fedt sure lipider, såsom POPC. Dog kan UF stadig fremkalde Rouleaux formation på lipoprotein, der indeholder mættede fedtsyregrupper lipider, såsom dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) og 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (PSPC). Den detaljerede mekanisme af denne interaktion er ukendt. UA / UF / FN kan alle arbejde ved lavere pH-værdier i intervallet fra 3,5 til 4,6. Sådanne lavere pH-værdier kan ikke egnet til visse biologiske makromolekyler, der er følsomme over for pH 14,71. Interessant, kan UA / UF fix proteinstruktur inden for et par millisekunder via en ukendt mekanisme 72. I modsætning til PTA, UA / UF er mere ligner et salt end en syre.
UF sigende kan give bedre resultater end UA 73, hvor den, UF og FN pletter har mindre kornstørrelser end UA (UF: 0,3 nm, FN: ~ 0,5 nm) 3,74. Et interessant eksempel, sekundære strukturelementer-lignende detaljer i et lille protein (53 kDa CETP) kan visualiseres direkte fra de rå micrographs når UF blev anvendt som negativ plet reagens ved at følgetidligere rapporteret cryo-positiv-farvning (cryo-PS) metode (figur 8) 6. I kryo-PS, den farvede prøve var lynfryses ved at følge cryo-EM prøveforberedelse procedure i stedet for tørring procedure i OpNS protokol, som kan forårsage sekundære sammenstyrtning. -PS kryo Den er en fremgangsmåde til høj kontrast og høj opløsning billeddannelse af små proteiner 75. Da cryo-PS billeder har vendt kontrast i forhold til dem fra den rapporterede cryo-NS-protokol 22, men har konsekvent billede kontrast til dem fra traditionelle cryo-EM billeder, så det blev navngivet cryo-PS-metoden. Cryo-PS billeder viser, at farvningsreagens uranyl formiat, trænger den molekylære overflade, udfordrer den konventionelle opfattelse, at farvning kan visualisere kun den ydre overflade struktur. Den mekanisme for, hvordan uranyl formiat trænger den molekylære overflade er ukendt. En mulighed er at uranyl kation binder tilgængelige protein carboxylgrupper og dermedomgivende glaslegeme isen er lavere densitet end farvningen af proteinet og uranyl koncerner og dermed fungerer som en positiv plet. Cryo-PS metode ligner multipel isomorf udskiftning (MIR) metode, som var en fælles tilgang til at løse fase problem i røntgenkrystallografi 76-78. I MIR er krystal prøverne gennemvædet med et tungt atom opløsning, herunder uran, for at få en isomorf form dets native form. Tilføjelsen af tungt atom undertiden ikke påvirker krystal dannelse eller enhedscelledele dimensioner, men giver yderligere oplysninger om krystalstruktur beslutsomhed 76-78. Ved at drage fordel af den lille gran af UF kunne cryo-PS giver en høj kontrast og høj opløsning billede af et enkelt protein, hvilket er vigtigt for protein struktur studier, især i betragtning af at næsten alle proteiner er naturligt dynamisk og uensartet i opløsning. Til validering af denne cryo-PS metode, åbner vi for en blindtest fra EM feltet. </p>
Saltkoncentration virkninger på rouleaux-dannelse i lipoproteiner
Brug af traditionelt PTA negativt farvningsreagens observeres rouleaux dannelse mere sandsynligt relateret til lipid interaktioner i stedet for protein-interaktion. Imaging prøver af POPC liposomvesikler fremstillet under stort saltindhold (0,5 M NaCI), moderat saltindhold (0,25 M NaCl), relativt svage saltindhold (0,1 M NaCI) og rent vand (figur 9), de elektronmikrofotografier viser rouleaux dannelse var korreleret til saltkoncentration (figur 9A – D). Brug af UF som negativ farvningsreagens blev ingen pengerulledannelse observeret i POPC liposomvesikel prøve 30 (figur 2L), hvilket antyder vaskeproceduren til hurtigt at reducere saltkoncentrationen lige før farvningen er en nødvendig, men ikke uafhængigt tilstrækkelig skridt til forebyggelse pengerulledannelse i POPC relateret prøver.
<p class="Jove_content"> TEM imaging lille protein kræver en nær-Scherzer fokus tilstand.Vellykket TEM billeddannelse af små proteiner ved højere opløsning kræver to kritiske forhold, en ordentlig stråle tilpasning og en nær-Scherzer erhvervelse fokus tilstand. i) En ordentlig lyshøjden kan bedømmes gennem antallet af synlige Thon ringe (power spektrum) på Fourier overdragelse af en carbon film billede erhvervet i henhold til en relativt høj Defocus. Jo bedre tilpasning tilstand af bjælken, kan flere Thon ringe visualiseres og målelige .. ii) Erhvervelse billede under en nær-Scherzer fokus er en anden kritisk tilstand. En traditionel standard strategi til billeddannelse af biologiske prøver anvender typisk høj defokusering (1 – 2 um og endnu mere), som kan forbedre den biologiske prøve billedets kontrast 79. Denne strategi er signifikant forskellige fra den typiske strategi til billeddannelse atomar opløsning struktur af hårde materialer, som ofteudnytter en nær Scherzer fokus (~ 50 nm Defocus). Selv kunne en højere Defocus styrke biologisk prøve Derimod ville i høj opløsning signaler være delvist fjernet. Som et resultat, vil medvirken af høj opløsning signal være lavere på et højere Defocus billeddannelse tilstand. Årsagen er, at TEM billede er foldning af prøve struktur og instrumentet CTF. CTF er en oscillerende kurve over frekvensen, hvor kurven ofte svinget krydser nul amplitude ved høj frekvens. Hver gang, når CTF tværs nul, prøven strukturelle signal på dette specifikke frekvens vil blive elimineret (nul gange et vilkårligt antal vil være nul). Den elimineret signal ved denne frekvens kan aldrig udvindes ved enhver CTF korrektion algoritme (et nul divideret med nul kan være en tilfældig nummer i stedet for det oprindelige strukturelle signal). Under højere defocus billeddannelse, vil CTF svinge meget mere aggressivt, således CTF krydser nul amplitude oftere, som et resultat,de strukturelle signaler ved et større antal specifikke frekvenser vil blive elimineret. Jo flere signaler, der elimineres, jo mindre meddelagtighed billedet vil have. Især kan medvirken af billedet ikke kan inddrives eller korrigeret af nogen CTF korrektion. Dog kan en række ikke gennemførte billeder optaget under forskellige defocuses bruges til at fylde deres huller til hinanden for at opnået en udfyldt strukturel signal af prøven struktur via en udjævning metode, hvor der kan opnås selv en atomar opløsning 9-12.
Den gennemsnit-metoden er en kraftfuld metode til at opnå struktur nogle meget symmetriske proteiner og strukturelt beslægtede stive proteiner. Dog er det stadig en udfordring i den strukturelle undersøgelse af små og asymmetriske proteiner, især for strukturelle dynamik og fleksible proteiner, såsom antistoffer og HDLs. Midling er baseret på den antagelse, at protein partikler er identiske i struktur og konformation, men different i orienteringer, er dog mange proteiner kendt for at gennemgå termodynamisk udsving i opløsning. Ved at anvende gennemsnit metode uden tidligere at kende protein termodynamiske udsvingsmargener udsving, kan det i gennemsnit struktur ofte medføre manglende domæner 10,80 eller lokal variation i resolution 81 i cryo-EM rekonstruktioner.
Succesen opnå 3D rekonstruktion af lille protein, såsom 53 kDa CETP og 3D-struktur af et enkelt protein, såsom 160 kDa IgG1-antistof, fordele ved at anvende nær-Scherzer fokus billeddannelse tilstand under en korrekt justering tilstand. Selv om billedet kontrast synes lav i nær-Scherzer fokus billeder, kan kontrasten let forbedret ved simpelthen at anvende et low pass filtrering for at reducere højfrekvent støj i baggrunden. Vi mener, det nær-Scherzer fokus billeder bære de maksimale strukturelle signaler, og kan øge nøjagtigheden af partikel tilpasning og øge effektiviteten i single-partikel 3D-rekonstruktion og individuel partikel elektron tomografi genopbygning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Mickey Yang til redigering og kommentarer og Drs. Lei Zhang og Bo Peng for assistance. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab, Kontoret for Basic Energi Sciences i USA Department of Energy (Kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231), National Heart, Lung, og Blood Institute of National Institutes of Health (ingen . R01HL115153), og National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health (nej. R01GM104427).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Stain: Uranyl Formate | The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc. | 02545-AA | http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml |
SYRINGE: 1ML NORM-JECT | VWR | 89174-491 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491 |
Syringe filter: 0.2 μm | VWR | 28145-487 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487 |
Syringe filter: 0.02 μm filter (Anotop 10) | Whatman | 6809-1002 | http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-Aldrich | D8537 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en®ion=US |
Parafilm: 4 in. x 125 ft. | VWR | 470152-246 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A |
Carbon film coated TEM grid: 300 mesh | Pacific Grid-Tech | Cu-300CN | http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon |
Carbon film coated TEM grid: 200 mesh | EMS (Electro Microscopy Sciences) | CF200-Cu | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx |
Tweezer: Dumont Tweezer L5 | EMS (Electro Microscopy Sciences) | 72882-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5 |
Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System | EMD Millipore | Milli-Q Advantage A10 | http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117 |
Filter Paper: Grade 1 circles | Whatman | 1001-090 | http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx |
Aluminum Foil | NA | NA | Any type |
Glow Discharge Unit | Ted Pella | 91000 | http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm |
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10µL Pipettors | VWR | 89174-520 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520 |
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40µL Pipettors | VWR | 89174-524 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524 |
Filter Tips: VWR Signature 200 µL Pipet Tips | VWR | 37001-528 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528 |
Pipet | Pipetman | F161201 and F167300 | http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx |