Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, bitkilerdeki genlerin geçici ektopik ekspresyonu için rutin fonksiyonel tahlillerdir. Bu yöntemler, efektoromik stratejilerde (hızlı direnç ve avirulence gen keşfi) etkili tahlillerdir ve moleküler bitki patolojisinde modern araştırmalar için çok önemlidir. Tesislerde sağlam yüksek verimli fonksiyonel analiz talebini karşılarlar.
Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, bitkilerdeki aday genlerin fonksiyonel analizi için iki etkili geçici ifade tahlilleridir. Agroinfiltrasyon için en sık kullanılan ajan, birçok dikot bitki türünün patojeni olan Agrobacterium tumefaciens’tir. Bu, agroinfiltrasyonun birçok bitki türüne uygulanabileceği anlamına gelir. Burada, bu yöntemleri patatese (Solanum tuberosum), ilgili yabani yumru taşıyan Solanum türlerine (Solanum bölümü Petota) ve model bitki Nicotiana benthamiana‘ ya uygularken protokollerimizi ve beklenen sonuçları sunuyoruz. Direnç (R) veya avirulence(Avr) genleri gibi tek genlerin fonksiyonel analizine ek olarak, agroinfiltrasyon tahlili, R ve Avr transgenes’i aynı hücreye teslim ederek belirli konak patojen etkileşimleriyle ilişkili R-AVR etkileşimlerini yeniden yakalamak için çok uygundur. Bununla birlikte, bazı bitki genotipleri Agrobacterium‘a spesifik olmayan savunma yanıtları örneğin birkaç patates genotipi için gözlemlediğimiz gibi yükseltebilir. Agroinfiltrasyon ile karşılaştırıldığında, PVX agroinfection ile AVR aktivitesinin tespiti daha hassastır, fonksiyonel ekranlarda daha yüksek verim ve Agrobacterium’aspesifik olmayan savunma yanıtlarına karşı daha az hassastır. Bununla birlikte, PVX’e spesifik olmayan savunma oluşabilir ve virüs kaynaklı aşırı direnç nedeniyle yanıtları kaçırma riski vardır. Bu sınırlamalara rağmen, deneyimlerimize göre, agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, birbirlerinin sonuçlarını doğrulamak için aynı anda kullanılabilecek hem uygun hem de tamamlayıcı testlerdir.
Effectoromics, yüksek verimli fonksiyonel genomik yaklaşım son zamanlarda mahsul bitkilerinde direnç (R) genlerini ve patojenlerin eşleşen avirulence(Avr) genlerini tanımlamak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır1-4. R genleri ile daha fazla zaman alan kararlı dönüşümün aksine, efekoromik stratejisi patojen gen dizilerinin geçici testlerine dayanmaktadır.
Genomik dönemden bu yana, bitki patojenlerinin genomları yaygın olarak araştırılmaktadır. Örneğin, en yıkıcı bitki patojenlerini içeren oomycetes için, bitki ile etkileşim sırasında rol oynayan genler için büyük dizi koleksiyonları oluşturulmuş ve analiz edilmiştir5-10. Patojen proteinlerinin bir sınıfı, enfeksiyonu (virülans faktörleri) kolaylaştırmak veya savunma yanıtlarını (avirulence faktörleri) tetiklemek için konak hücre yapısını ve işlevini manipüle eden efektörleri temsil eder11-13. R genleri içeren bitki hücrelerinde Avr genlerinin ekspresy ekspresyotiği genellikle aşırı duyarlı hücre ölüm yanıtı (HR)14,15ile sonuçlanır. R ve Avr genlerinin planta ifadesinde Agrobacterium tumefaciensgibi geçici ekspresyon sistemleri kullanılarak gerçekleştirilebilir – tabanlı geçici dönüşüm (agroinfiltrasyon)16. Bu geçici dönüşüm viral ekspresyon sistemleri (agroinfection)17,18ile birlikte de uygulanabilir.
Agroinfiltrasyon için, en sık kullanılan ajan, dikot bitkilerinin geniş bir konak aralığı patojeni olan A . tumefaciens’tir. A . tumefaciens tümör indükleyen (Ti) plazmid içerir. Bir Ti plazmidinden DNA (T-DNA) transferi, bakterinin virülans makineleri aktive edildikten sonra bitki hücrelerine yerleştirilecektir. Bu, hafif asidik bir ortamda salınan düşük moleküler ağırlıklı fenolik bileşikler ve monoakkaritler tarafından yaralı bitki hücrelerinde tetiklenebilir19. Virülans geni, Agrobacterium süspansiyonlarının ana damarlar tarafından tanımlanan yaprak panellerine sızması sonrasında aktive edilir. Daha sonra yaprak panellerindeki bitki hücreleri dönüştürülecek ve T-DNA bölgesinde bulunan transgene(ler) ifade edilecektir.
Agroinfection, bir virüsün bitki hücrelerine nakline aracılık eden yara aşılanmış Agrobacterium‘a dayanır. Virüs daha sonra Agrobacteriumyokluğunda bitişik bitki dokularına daha da yayılır. Agroinfection için birkaç bitki virüsü kullanılabilir. RNA virüsleri gen ekspresyörü için ideal vektörlerdir çünkü enfekte bitkilerde çok yüksek seviyelere çarpabilirler. Bitki RNA virüsleri arasında, Patates Virüsü X (PVX) efekoromik ekranlar için yaygın olarak kullanılır. Eklenen bir gen için fonksiyonel testleri kolaylaştırmak için, Karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü ve nopalin sintans terminatörü tarafından kuşatılan PVX genomu içeren ikili vektörler, A. tumefaciens20’ninT-DNA’sına klonlandı. T-DNA bitki hücrelerine aktarıldıktan sonra, T-DNA’da bulunan PVX genom 35S promotöründen yazıya dökülür. Daha sonra virüs parçacıkları enfekte bitkilerde sistemik olarak yayılır ve eklenen genin ekspresykülü ile sonuçlanır. Hem Agrobacterium hem de PVX’e dayanan bu yönteme PVX agroinfection denir.
Burada hem agroinfiltrasyon hem de PVX agroinfection tahlilleri için örnekler gösteriyoruz. Konak bitkiler olarak, efekoromik yaklaşımların öncülük edildiği ve başarılı olduğu kanıtlanmış patates germplasm(Solanum bölümü Petota)kullanıyoruz3,4. Biz de kullanırız Nicotiana benthamiana, Solanaceous bitkilerinde bir model bitki olarak ünlüdür14,21,22.
Agroinfiltrasyon ve agroinfection gibi geçici tahliller, modern moleküler bitki patolojisi araştırmaları için hayati önem taşıyan etkili yöntemlerdir. Bazı sınırlamalara rağmen, bu yöntemler tesislerde verimli ve sağlam yüksek verimli fonksiyonel analiz talebini karşılar.
Agroinfiltrasyon sistemi, çeşitli bitki türlerinde yaygın olarak kullanılan işlevsel bir testtir. Agroinfiltrasyon, etkileşime giren proteinlerin eşzamanlı ifadesiyle aynı hücreye birkaç transjenin verilmesini kolaylaştırır. Bu, Avr genlerini ifade eden Agrobacterium suşlarını eşleşen R genlerini ifade eden suşlarla birleştirmekle R-AVR ilişkilerinin yeniden kapsüllanması için avantajlıdır. Ayrıca, bilinen R-AVR çiftleri için, bu tür coinfiltrations pozitif kontroller olarak kullanılabilir. Bu tür denetimlerin dahil edilmesi önemlidir, çünkü bazı bitki genotiplerinde, dönüşüm verimliliği yanıtları algılamak için eşiğin altında olabilir. Negatif kontroller de dahil olmak üzere, örneğin gen kesici ucu olmayan bir vektör içeren bir Agrobacterium suşu, belirli bir bitki genotipinin Agrobacterium’aspesifik olmayan savunma yanıtlarını yükseltip yükseltmediğini belirlemek için de gereklidir. Bu özellik patates germplazmasında belirli bir sıklıkta ortaya çıkar ve tüm Solanum türleri bu Agrobakterimbazlı ifade sistemi için iyi uygun değildir. Genellikle, agroinfiltrasyon tahlilleri N. benthamiana ve çoğu patates genotipinde çok iyi çalışır. Efekoromiklere ek olarak, agroinfiltrasyon tekniği için transgenelerden protein üretimi ve konfokal mikroskopi ile bitki hücrelerinde protein lokalizasyonu gibi çeşitli potansiyel uygulamalar vardır.
PVX agroinfection oldukça hassas bir tarama sistemidir ve genellikle yüksek verimli taramalar için daha uygundur. Agrobacterium artık sadece yerel olarak mevcut olduğundan, PVX virüsü transjenin daha fazla yayılmasını ele aldığından, bu bakteriye spesifik olmayan yanıtlar artık çok rahatsız edici değildir. Bununla birlikte, bitkiler PVX’e karşı dirençli olabilir veya aşırı direnç (ER) yanıtları monte edebilir ve bu durumda agroinfeksiyon yöntemi uygun değildir. PVX agroinfection yönteminin bir başka sınırlaması, ilgi çekici genin kesici uç boyutudur. Gözlenen yanıt fenotipleri, yarayı çevreleyen yoğun siyah nekrozdan aşı noktasının yakınındaki soluk nekroza kadar değişebilir. Hem N. benthamiana hem de Solanum türlerinde, PVX agroinfection agroinfiltrasyondan daha hassas olarak kabul edilir.
Çeşitli test edilmiş bitki genotiplerinin genetik arka planının bazı kısıtlamalara sahip olabileceğini göz önünde bulundurarak (yukarıya bakın), genellikle PVX agroinfection ve agroinfiltrasyon ile benzer sonuçlar elde ediyoruz. Bu sonuçlar, protein infiltrationları29 ve ELISA3gibi diğer tahlillerde elde edildiği gibi karşılaştırılabilir. Her iki sistemin avantajlarını ve sınırlamalarını göz önünde bulundurarak, birbirini tamamlamak veya bağımsız sonuçları onaylamak için her iki yöntemi de kullanmanızı öneririz.
The authors have nothing to disclose.
Çalışma kısmen Wageningen Üniversite Fonu (WUF), Çin Lisansüstü Öğrenciler Burs Konseyi Programı ve 12378 NWO-VIDI hibesi tarafından desteklenmektedir.
Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
Incubator | Infors HT | Multitron II | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |