Кишечные бактериальной инвазии эпителиальных клеток кишечника<em> In Vitro</em> Резко усиливается с помощью вертикальной модели диффузионной камере

Взаимодействие бактериальных патогенов с клетками-хозяевами были широко исследованы использованием методов пробирке культуре клеток. Использование таких клеточных культур, бактериальной адгезии к клеткам хозяина, определение рецепторов клетки-хозяина, клетки-хозяина сигнальных путей и бактериальной инвазии клеток-хозяев, все были подробно изучены, в результате чего многие важные наблюдения. Однако такой анализ культуры клеток в аэробных условиях, которые не могут быть представителем в естественных условиях окружающей среды. Главное ограничение в пробирке модели, используемые для изучения желудочно-кишечных инфекций в том, что условия культивирования включая высокий уровень кислорода в целом одобряют эукариотических выживания клетки. Однако условия в просвете кишечника будет почти анаэробных. Кишечных патогенов в очень низкой кислородной среде выразить гены вирулентности, экспрессия которых изменения в аэробных условиях ^2. Таким образом, данные, полученные с использованием стандартных клеточных культур моделях май дают неточные указания бактериального взаимодействия с клетками-хозяевами.

Campylobacter джеджуни является ведущим возбудителем бактериального острого гастроэнтерита по всему миру, с симптомами, которые варьируются от легкой диареи до тяжелых воспалительных энтерита. Большинство С. джеджуни инфекции приводят в неосложненных гастроэнтерита, однако C. джеджуни также, наиболее часто упоминаемой инфекционного агента в периферические невропатии, включая синдром Гийена-Барре (СГБ). В Великобритании, по оценкам, насчитывается более 500 000 случаев энтерита вызванных C. джеджуни инфекции каждый год с прогнозируемой стоимостью в экономику Великобритании в размере £ 580 000 000. В развивающихся странах, C. джеджуни является ведущей причиной смертности среди детей. Несмотря на несомненную важность инфекции Campylobacter и десятилетия исследований, в том числе тщательное геномики на основе анализа, C. джеджуни патогенеза еще плохо understООД, в отличие от других кишечных патогенов, таких как сальмонелла, кишечная палочка, шигеллы, и холерный вибрион. Отсутствие удобных маленькая модель животного одна из главных причин для этого ^3. Также широко используется в моделях пробирке инфекции более подходит для изучения микроаэрофильная C. джеджуни, чем для других кишечных патогенных микроорганизмов, которые являются факультативными анаэробами. Хотя C. джеджуни признан инвазивного возбудителя, механизмы C. джеджуни вторжения в эпителиальные клетки кишечника (IECS) до сих пор неясны ^4,5. C. джеджуни вторжение было показано, зависит от или микрофиламентов, микротрубочек, сочетание оба или ни ^5. Путаницы в этой области, скорее всего, за счет использования ненадлежащих условиях в пробирке анализа.

Ряд различных анализах культуры клеток были использованы для исследования взаимодействия С. джеджунис клетками-хозяевами. Caco-2, ^{6, 7} INT 407 и T84 ⁸ клеточные линии все были использованы для изучения адгезии и инвазии возможностей различных C. джеджуни штаммов. Однако уровни бактериальной адгезии и инвазии для C. джеджуни с IECS значительно ниже, чем для других кишечных патогенов ^9. Сокультивирования С. джеджуни с IECS обычно выполняется в СО _{2-инкубаторе} в условиях, близких к атмосферному уровня кислорода, необходимого для выживания IECS. C. джеджуни экспрессии генов будет сильно отличаться в среде с низким кислородом просвет кишечника по сравнению с атмосферным условиям кислорода.

Использование вертикальной диффузионной камеры (VDC) была разработана система, которая позволяет совместное культивирование бактерий и клеток-хозяев в различных средних и газа условиях ^1,10,11. Эта система имитирует условия в кишечнике человека, где бактерии будет ООНдер условиях очень низких ткани в то время как кислород будет снабжаться кислородом из крови. Поляризованные монослоев IEC выращивают в специальных фильтров 0,4 мкм помещали в создании постоянного тока апикальной и базолатеральной отсек, которые были индивидуально заполнены бактериальный бульон и среды культуры клеток соответственно (рис. 1). В постоянного тока помещали в атмосферу переменной инкубаторе, содержащем 85% N _2, 5% O _{2 и} 10% CO ₂ при 37 ° С, представляя оптимальные условия для C. джеджуни. Верхушечный отсека осталась открытой и подверженной микроаэробных атмосфера в переменной атмосферу инкубатора, в то время как запечатанные базолатеральным отсек снабжаются кислородом постоянным введением 5% CO _2/95% O ₂ газовой смеси с выходной трубкой предотвращения накопления давления . Сасо-2 выживание клеток и монослой целостность при этих условиях были подтверждены путем мониторинга трансэпителиальная элементctrical сопротивления (TEER) через монослой в течение 24 часов, чтобы продемонстрировать выживаемость клеток Сасо-2 монослой клеток и физическое разделение апикальной и базолатеральной отсеков в условиях низкой кислорода в апикальной отсека. TEER монослоев в ДКР поддерживается в переменной атмосфере инкубатора (микроаэробных условий) и в стандартной клеточной культуры CO _{2-инкубаторе} (аэробных условиях) не показали значительных различий, что указывает на целостность монослоя клеток при различных атмосферных условиях ^1. В микроаэробных условиях плотных соединений остался настоящим и равномерно распределены между границами ячеек с помощью рисунка окклюдина окрашивания похожи на клетки поддерживаются в аэробных условиях ^1.

Взаимодействия C. джеджуни с Caco-2 и T84 клеток в VDC были исследованы оценки взаимодействия бактериальных (адгезия и инвазия) и вторжения. Два разных C. джеджуни дикого типа Straiнс были использованы ^1. C. джеджуни 11168H является hypermotile производной исходного штамма NCTC11168 последовательности. 11168H штамм демонстрирует гораздо более высокие уровни колонизации в модели колонизации кур и, таким образом, рассматриваться в качестве подходящего штамма использовать для хозяин-патоген исследования взаимодействия. 81-176 является человеком изолировать и является одним из наиболее широко изученных инвазивных лабораторных штаммов. С. джеджуни штаммы были добавлены к апикальной отсеке постоянного тока в соответствии либо микроаэробных или аэробных условиях. Мы наблюдали более высокие ставки для взаимодействия и вторжения были записаны для C. джеджуни в микроаэробных условия ^1. Повышенная C. джеджуни взаимодействия не за счет увеличения числа бактерий в микроаэробных условия ^1. Эти данные подтверждают нашу гипотезу, что низкая среде кислорода в апикальной отсеке VDC улучшает бактерии-хозяина взаимодействий и показывает, что инвазивные свойства C. джеджуни являются INCRоблегчили в этих условиях. Это было первое сообщение об использовании модели постоянного тока для изучения инвазивных бактериальных патогенов и подчеркивает важность выполнения анализов в пробирке инфекции в условиях, которые более точно имитировать в естественных условиях ситуации. Модель постоянного тока может быть использована для изучения хозяин-патоген взаимодействия для различных видов бактерий.