Bağırsak Epitel Hücreleri Of Enterik Bakteriyel Invasion<em> In Vitro</em> Dramatik bir Dikey Difüzyon Odası Modeli Geliştirilmiş mı
Summary
Aerobik koşullarda bakteri yapışma ve işgali araştırmak için hücre kültürü deneyleri Sahne genellikle temsil edici olduğu<em> In vivo</em> Ortam. Bir Dikey Difüzyon Odası modeli insan patojen etkileşimleri çalışma sağlar<em> Campylobacter jejuni</em> Daha altında bağırsak epitel hücreleri ile<em> In vivo</emKoşullar> gibi, gelişmiş bakteri istilası sonucu.
Abstract
Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenler etkileşimleri, in vitro hücre kültürü yöntemleri kullanılarak yoğun bir şekilde araştırılmıştır. Bu hücre kültürü deneyleri aerobik şartlar altında gerçekleştirilir Ancak, bu in vitro modellerde doğru konak-patojen yer aldığı in vivo ortamda temsil olmayabilir. Farklı orta ve gaz koşullarında bir bakteri ve konak hücrelerin kokültürü izin enfeksiyonun bir in vitro modeli geliştirdik. Dikey difüzyon hücresinde (VDC) modeli bakteriler çok düşük oksijen iken doku koşulları altında olacak insan bağırsak koşulların kan akışından oksijen ile tedarik edilecek taklit eder. Bir VDC içine Snapwell ekler yetiştirilen polarize bağırsak epitel hücre (IEC) mono tabakaları yerleştirilmesi ayrı apikal ve bazolateral bölmeleri oluşturur. Bazolateral bölmesi, hücre kültür ortamı ile doldurulmuş ve kapatılmış oksijen w ile perfüzeApikal bölmesi Hilst suyu ile doldurulur, açık tutulur ve mikroaerobik koşullar altında inkübe edildi. Caco-2 ve T84 Hem IECS hücre yaşamını ya da tek tabaka bütünlüğü üzerinde belirgin bir zararlı etki olmaksızın, bu koşullar altında VDC korunabilir. Coculturing deneyler değişik C ile gerçekleştirilir apikal bölmeye mikroaerobik koşullara jejuni, vahşi tip suş ile VDC model içinde farklı IEC hattı tekrarlanabilir aerobik kültür koşulları ile karşılaştırıldığında bir etkileşim sayısı (yaklaşık 10 kat) artış ve hücre içi (hemen hemen 100 kat) bakterilerin neden 1. VDC modeli oluşturulan ortamı daha yakından C. karşılaştığı çevre taklit eder ve insan bağırsak jejuni daha yakından in vivo gerçekte taklit eden şartlar altında in vitro enfeksiyon deneyleri gerçekleştirmek önemini vurgulamaktadır. Biz VDC modelinin kullanımının etkileşim yeni yorumlar bahis sağlayacak teklifbakteriyel patojenler ve konak hücreleri da muhtemelen bir.
Introduction
Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenler etkileşimleri, in vitro hücre kültürü yöntemleri kullanılarak yoğun bir şekilde araştırılmıştır. Bu hücre kültürü deneyleri, ev sahibi hücrelere bakteriyel yapışma, konak hücre reseptörleri, yollar ve ev sahibi hücrelerin bakteri istilası sinyal konak hücrenin kimlik kullanan tüm birçok önemli gözlemler sonucu, ayrıntılı olarak incelenmiştir. Ancak bu hücre kültürü deneyleri in vivo ortamda temsil olmayabilir aerobik koşullar altında yapılmaktadır. Gastrointestinal enfeksiyonlar incelemek için kullanılan in vitro modellerinde önemli bir sınırlama yüksek oksijen seviyesi de dahil olmak üzere kültür koşulları genellikle ökaryot hücre sağkalım lehine olmasıdır. Bununla birlikte, bağırsak lümeninden koşulların hemen hemen anaerobik olacaktır. Çok düşük bir oksijen ortamında enterik patojenlerin olan ekspresyon değişikliği aerobik şartlar altında 2 enfeksiyon genlerini ifade eder. Bu nedenle, veri standart hücre kültürü modelleri m kullanılarak eldeay konak hücreleri ile bakteriyel etkileşimlerin bir yanlış göstergesidir.
Campylobacter jejuni hafif ishal şiddetli enflamatuar enterit değişir bu belirtiler, dünya çapında bakteriyel akut gastroenterit önde gelen etken olduğunu. C çoğunluğu basit gastroenterit jejuni enfeksiyonları sonucu, ancak C. jejuni da Guillain-Barre sendromu (GBS) dahil olmak üzere çevresel nöropatiler, en yaygın olarak tespit bulaşıcı bir ajandır. İngiltere'de, bu C'nin neden enterit 500.000 'den fazla vaka olduğu tahmin edilmektedir 580.000.000 £ Birleşik Krallık'ın ekonomisine tahmin maliyeti jejuni enfeksiyonu her yıl. Gelişmekte olan ülkelerde, C. jejuni çocuklar arasında ölüm önde gelen nedenidir. Şüphesiz Campylobacter enfeksiyon önemi ve kapsamlı genomik-tabanlı analiz, C dahil olmak üzere araştırma yıllardır rağmen, jejuni patogenezi hala tam underst olduğunuood, Salmonella, Escherichia coli, Shigella, ve Vibrio cholerae gibi diğer enterik patojenler aksine. Uygun bir küçük hayvan modeli eksikliği bu 3 için önemli bir nedenidir. Ayrıca yaygın olarak in vitro enfeksiyon modellerinde kullanılan mikroaerofilik C çalışmak için daha uygun değildir fakültatif anaeroblar diğer enterik patojenler için daha jejuni. Iken C. jejuni istilacı patojen, C. mekanizmaları olarak kabul edilmektedir bağırsak epitel hücrelerinin jejuni işgali (IECS) hala 4,5 belirsiz. C. jejuni işgal ya mikrofilamanlar, mikrotübüller, her ikisi de bir arada ya da ikisinin de 5 bağımlı olduğu gösterilmiştir. Bu alanda karışıklık muhtemelen in vitro test koşullarında uygunsuz kullanım kaynaklanmaktadır.
Farklı hücre kültürü analizlerinden bir dizi C etkileşimi araştırmak için kullanılmıştır jejuniev sahibi hücrelerle. Caco-2 6, INT 407 7, 8 ve T84 hücre hatları tüm farklı C. adhezyon ve invazyon yetenekleri incelemek için kullanılmıştır jejuni suşları. Ancak, C. için bakteriyel yapışma ve invazyon seviyeleri IECS ile jejuni diğer enterik patojenler 9 daha önemli ölçüde düşüktür. C. coculturing IECS ile jejuni, normal IECS hayatta kalması için gerekli atmosferik oksijen seviyeleri yakın koşullar altında bir CO2 inkübatör içinde gerçekleştirilir. ° C. jejuni gen ekspresyon atmosferik oksijen koşullarına göre bağırsak lümen düşük oksijen ortamda çok farklı olacaktır.
Dikey bir difüzyon hücresinde (VDC) sistemi kullanımı, farklı orta ve gazı koşulları altında 1,10,11 bakteri ve konak hücrelerin kokültürü izin veren geliştirilmiştir. Bu sistem bakteri un olacak insan bağırsak koşullarını taklitçok düşük oksijen iken doku der koşulları kan akışından oksijen ile tedarik edilecektir. Özel bir 0.4 mikron filtre yetiştirilen Polarize IEC mono tabakaları bireysel bakteriyel suyu ve sırasıyla, hücre kültürü ortamı (Şekil 1) ile doldurulmuş bir apikal ve bazolateral bölmesi, oluşturma VDC içine yerleştirildi. VDC değişken bir atmosfer inkübatöründe 37% 85 N2,% 5 O2 ve% 10 CO2 içeren ° C, C için en uygun koşulların temsil yerleştirildi jejuni. Apikal bölmesi açık bıraktı ve değişken atmosfer inkübatör içinde mikroaerobik atmosfere maruz kalmış, kapalı bazolateral bölmesi iken% 5 CO 2 / basınç birikimi engelleyen bir çıkış borusu ile% 95 O 2 gaz karışımı sürekli yönetimi tarafından oksijen ile sağlanan . Bu koşullar altında, Caco-2 hücre hayatta kalması ve tek tabaka bütünlüğü transepitelyal ele izlenmesi ile doğrulanmıştır24 saat boyunca tek tabaka üzerinde ctrical direnci (TEER), apikal bölmeye düşük oksijen koşullarında apikal ve bazolateral bölmelerinin Caco-2 hücre tek ve fiziksel olarak ayrılması hayatta göstermek için. Değişken atmosfer inkübatör (Mikroaerobik koşulları) ve bir standart hücre kültürü CO 2 inkübatör (aerobik koşullarda) muhafaza VDCs içinde mono tabakaları TEER farklı atmosferik koşullar 1 altında hücre tek tabaka bütünlüğünü gösteren, anlamlı farklılık gösterdi. Mikroaerobik koşullar altında, sıkı bağlantıları mevcut ve eşit aerobik koşullarda 1 altında muhafaza hücreleri benzer bir occludin boyama deseni ile hücre sınırları arasında dağıtılır kaldı.
C. etkileşimleri VDC Caco-2 ve T84 hücreleri ile jejuni bakteriyel etkileşim (yapışma ve işgali) ve işgali değerlendirerek incelenmiştir. Iki farklı ° C. jejuni yabani tip strains 1 kullanıldı. C. jejuni 11168H orijinal dizisi gerginlik NCTC11168 bir hypermotile türevidir. 11168H gerginlik bir civciv kolonizasyon modelinde çok daha yüksek kolonizasyon düzeyi gösterir ve bu nedenle konak-patojen etkileşim çalışmaları için kullanılacak uygun bir gerginlik olarak kabul edilir. 81-176 bir insan izole etmek ve en invaziv yaygın olarak incelenmiştir laboratuar suşları biridir. ° C. jejuni suşları mikroaerobik veya aerobik şartlar altında bir ya da VDC apikal bölmesine ilave edildi. Biz etkileşim ve işgali hem de yüksek oranda C için kaydedildi gözlenen mikroaerobik koşullar 1. altında jejuni. Artan ° C. jejuni etkileşimleri mikroaerobik koşullar 1 altında bakteri sayısındaki artış nedeniyle değildi. Bu veri VDC apikal bölmesinde düşük oksijen ortamında bakteri-konak ilişkileri geliştirir ve gösterir bizim hipotezi desteklediği C invaziv özellikleri jejuni incr olanBu koşullar altında hafifletti. Bu invaziv bakteriyel patojen incelemek için VDC modelinin kullanımının ilk rapor ve daha yakından in vivo durumda taklit koşullarda in vitro enfeksiyon tayinlerde performans önemini vurgulamaktadır. VDC modeli çok farklı bakteri türleri için konak-patojen etkileşimleri çalışmak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenlerin etkileşimleri incelemek için in vitro hücre kültürü yöntemleri içinde kullanımı yaygın olarak pek çok araştırma laboratuarlarında kullanılan bir tekniktir. Bu hücre kültürü deneyleri aerobik şartlar altında gerçekleştirilir Ancak, bu in vitro modellerde doğru konak-patojen yer aldığı in vivo ortamda temsil olmayabilir. Yaygın olarak in vitro enfeksiyon modellerinde kullanılan mikroaerofilik <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dominic Mills Bloomsbury Kolejler Doktora Bursu (2007-2010) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar VDC modeli gelişmekte olan onların yardım için Ozan Gündoğdu ve Abdi Elmi de teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
Riferimenti
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J., Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. Chapter 17. Campylobacter. , 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
