جيل من الفيروسة الرملية المؤتلف استحداث اللقاحات وافقت عليها الهيئة في خلايا فيرو
Summary
إنقاذ arenaviruses المؤتلف من cDNAs المستنسخة، وهو نهج يشار إلى عكس علم الوراثة، ويسمح للباحثين للتحقيق في دور الجينات الفيروسية منتجات محددة، فضلا عن مساهمة من المجالات الخاصة المختلفة والمخلفات، إلى العديد من الجوانب المختلفة للبيولوجيا الفيروسة الرملية . وعلى نحو مماثل، عكس تقنيات الوراثة في خطوط الخلايا وافقت عليها الهيئة (فيرو) لتطوير لقاح يوفر إمكانيات جديدة لتوليد لقاحات فعالة وآمنة لمكافحة arenaviruses المسببة للأمراض البشرية.
Abstract
تطوير وتنفيذ الفيروسة الرملية عكس علم الوراثة يمثل انفراجة كبيرة في مجال الفيروسة الرملية 4. استخدام نظم minigenome الفيروسة الرملية المستندة إلى الخلايا جنبا إلى جنب مع القدرة على توليد المؤتلف arenaviruses المعدية مع الطفرات محددة سلفا في الجينوم الخاصة بهم سهلت التحقيق في مساهمة المحددات الفيروسية إلى الخطوات المختلفة لدورة حياة الفيروسة الرملية، وكذلك في استضافة فيروس تفاعلات وآليات الفيروسة الرملية المرضية 1، 3، 11. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير arenaviruses trisegmented أباح استخدام الجينوم الفيروسة الرملية للتعبير عن الجينات الغريبة إضافية من الفائدة، مما فتح إمكانية المستندة إلى التطبيقات الفيروسة الرملية ناقلات اللقاح 5. وبالمثل، وتطوير دورة واحدة arenaviruses المعدية قادرة على التعبير عن الجينات مراسل يوفر أداة تجريبية جديدة لتحسين سلامة الأبحاث التي تنطوي على HIGHLY المسببة للأمراض arenaviruses الإنسان 16. وقد اعتمد الجيل من arenaviruses المؤتلف باستخدام تقنيات الوراثة العكسية القائمة على البلازميد حتى الآن على استخدام خطوط الخلايا القوارض 7،19، الأمر الذي يشكل بعض العوائق لتطوير إدارة الغذاء والدواء (FDA) المرخصة لقاح أو ناقلات اللقاح. للتغلب على هذه العقبة، ونحن هنا وصف الجيل كفاءة arenaviruses المؤتلف في خلايا فيرو وافقت عليها الهيئة.
Introduction
Arenaviruses هي فيروسات يلفها مع bisegmented، السلبية تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي الجينوم 3 التي تنتمي إلى عائلة الفيروسات الرملية. الجينوم الفيروسة الرملية بترميز أربعة بروتينات بطريقة ambisense من جزأين منفصلين 3 الفيروسية. لشريحة كبيرة (L) بترميز الحمض النووي الريبي بوليميراز RNA التي تعتمد على (L) وحلقة صغيرة (مثيرة للاهتمام حقا جين جديد) البروتين إصبع (Z) التي هي بمثابة القوة الدافعة الرئيسية للفيروس في مهدها. الصغيرة (S) الجزء بترميز البروتين النووي الفيروسي (NP) وبروتين سكري سطح (GP) (الشكل 1).
عدة أعضاء من عائلة الفيروسات الرملية هي المسؤولة عن الحمى النزفية القاتلة (HF) في البشر 3. من الشواغل مبدأ هي اسا فيروس (LASV) وفيروس جونين (JUNV)، التي من المعروف أنها تسبب ارتفاع معدل الوفيات في المرضى في المستشفى 8، 9. على الرغم من أن هذه الفيروسات تستوطن غرب أفريقيا والأرجنتين الريفية، على التوالي،هناك مخاوف متزايدة من استيراد LASV وJUNV إلى المناطق غير الموبوءة وذلك بسبب زيادة السفر 10. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن لا ترتبط عادة مع مرض شديد في البشر، ويعتبر فيروس التهاب السحايا المشيمي الفيروسة الرملية prototypic الليمفاوي (LCMV) الممرض المهملة كما كانت هناك حالات من العدوى القاتلة في مرضى نقص المناعة 6، 15 ويكون مسؤولا عن العيوب الخلقية والإجهاض العفوي في النساء الحوامل 2، 13. حاليا لا توجد وافقت عليها الهيئة لقاحات ضد arenaviruses والعلاج يقتصر على نيوكليوسيد التناظرية ريبافيرين، والتي لا تكون فعالة إلا جزئيا وغالبا ما ترتبط مع آثار جانبية كبيرة في الولايات المتحدة.
إدخال العكسي القائم على البلازميد الوراثة 4 و الجيل من arenaviruses المؤتلف 7، 19 تقدمت إلى حد كبير مجال البحث الفيروسة الرملية. حاليا، تستخدم خلايا القوارض (مثل BHK-21) لينايرأوجه من arenaviruses المؤتلف ويرجع ذلك إلى أنواع محددة الفئران الحمض النووي الريبي بوليميراز I (POL-I) مروج توجيه النسخ الأولية للS وشرائح L. لكن الإنقاذ الفيروس في BHK-21 الخلايا ليست أسلوب معتمد لتوليد arenaviruses المؤتلف كمرشحين بذور اللقاح المحتملة. نحن هنا توثيق استخدام الإنسان POL-I المروج للانقاذ كفاءة من العالم القديم prototypic (OW) LCMV والعالم الجديد (NW) JUNV صريح # 1 السلالة في خلايا فيرو. باستخدام منهجية مماثلة، ونحن ولدت المؤتلف LCMV trisegmented (r3LCMV) وصريحة # 1 (r3Candid # 1) arenaviruses التي تحتوي على اثنين من الجينات المشفرة أجنبية إضافية في اثنين من مختلف شرائح S RNA 5. هذا النظام الجديد التالي ليس فقط على بروتوكول استنساخه للغاية وبسيطة ولكن يمكن تنفيذها فورا في توليد arenaviruses المؤتلف لقاح محتمل أو البذور ناقلات اللقاح.
Protocol
Representative Results
Discussion
أصبح جيل من arenaviruses المؤتلف باستخدام تقنيات الوراثة العكسية القائمة على البلازميد نهج المستخدمة على نطاق واسع للتحقيق في العديد من جوانب مختلفة من علم الأحياء الفيروسة الرملية. نحن هنا توثيق تحسن حاسم في النظام الحالي عن طريق إجراء الفيروسة الرملية عمليات الإنقاذ ف?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر أعضاء سابقون وحاليون في JCT والمختبرات LM-S من أجل تطوير وتحسين العكس الفيروسة الرملية تقنيات الوراثة والبلازميدات. كما نشكر سنيجانا ديميتروفا حصول على الدعم الفني. تم الحصول على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموجهة إلى JUNV NP (SA02-BG12) من BEI الموارد (المعدية الدفاع البيولوجي والناشئة التهابات بحوث الموارد مستودع). كان مدعوما من قبل BYHC منحة GM068411 عدد من المؤسسات روث L. كيرشتاين جائزة الخدمة الوطنية للبحوث. EO-R هو فولبرايت-Conicyt (BIO 2008) وروتشستر لقاح زمالة (2012) المتلقية. يتم توفير الدعم EO-R الحالي بوضع زمالة ما بعد الدكتوراه للتنوع والتميز الأكاديمي من مكتب للتنمية كلية والتنوع في جامعة روتشستر. ويتم تمويل البحوث في LM-S مختبر من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح RO1 AI077719، R21NS075611-01، R03AI099681-01A1، ومراكز المعدية التميز لأبحاث الأنفلونزا والمراقبة (HHSN266200700008C)، ومركز جامعة روتشستر للنمذجة الدفاع البيولوجي المناعي (HHSN272201000055C).
وأيد البحوث في المختبر من قبل جي سي تي المنح RO1 AI047140، RO1 AI077719، وRO1 AI079665 من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Material and methods | |||
|
Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA. |
Riferimenti
- Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
- Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).
- Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C., Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields’ Virology. 2, 179201827 (2007).
- Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
- Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
- Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
- Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
- Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
- Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
- Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
- Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
- Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
- Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
- Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
- Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
- Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
- Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
- Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
- Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).
