Wir beschreiben eine neuartige<em> In vivo</em> Bildgebendes Verfahren, dass Paare fluoreszierenden chimären Mäusen mit intrakraniellen Fenster und hochauflösende 2-Photonen-Mikroskopie. Das Imaging-Plattform Hilfsmittel Studien von dynamischen Veränderungen im Hirngewebe und Mikrovaskulatur, bei einer Ebene einzelner Zellen, nach pathologischer Beleidigungen und ist anpassungsfähig an intrakraniellen Droge Lieferung und Verteilung zu beurteilen.
Wir haben erfolgreich integriert zuvor Intracranial Fenster (ICW)-Technologie mit 1-4 intravital etablierten 2-Photonen konfokalen Mikroskopie, eine neuartige Plattform, die für die direkte langfristige Visualisierung der Gewebestruktur ermöglicht Änderungen intrakranial entwickeln. Imaging in einer einzigen Zelle Auflösung in einer Echtzeit-Mode bietet zusätzliche dynamische Informationen über die von Standard-Endpunkt histologische Analyse, die allein betrachtet "Snap-shot 'Querschnitte von Gewebe zur Verfügung gestellt.
Die Errichtung dieser intravital bildgebendes Verfahren in fluoreszierenden chimären Mäuse, sind wir in der Lage, Bild vier fluoreszierende Kanälen gleichzeitig. Durch die Integration von fluoreszenzmarkierten Zellen, wie zB GFP + Knochenmark, ist es möglich, das Schicksal dieser Zellen studieren ihre langfristige Migration, Integration und Differenzierung innerhalb des Gewebes zu verfolgen. Eine weitere Integration von einem sekundären Reporter Zelle, wie einer mCherry Gliomtumor Linie ermöglicht Zeichenrakterisierung der Zelle: Zell-Interaktionen. Strukturelle Veränderungen im Gewebe Mikroumgebung kann durch die Zugabe von intra-vital Farbstoffe und Antikörper markiert werden, zum Beispiel CD31 Antikörper markiert und Dextranmolekülen.
Darüber hinaus beschreiben wir die Kombination unserer ICW Imaging-Modell mit einem kleinen Tier Mikro-Strahler, die stereotaktische Bestrahlung stellt, die Schaffung einer Plattform, über die die dynamischen Veränderungen, die Gewebe nach der Verabreichung von ionisierender Strahlung auftreten beurteilt werden können.
Diese Einschränkungen der Modell umfassen penetrance des Mikroskops, die bis zu einer Tiefe von bis zu 900 um von der subkortikalen Oberfläche begrenzt ist, die Begrenzung Bildgebung zur dorsalen Achse des Gehirns. Die Anwesenheit der Schädelknochen macht die ICW eine anspruchsvolle technische Verfahren, im Vergleich zu den etablierten und genutzt Kammer Modelle, die gerade verwendet werden, um Brustgewebe und Fettpolster 5-7 studieren. Darüber hinaus ist die ICW provides viele Herausforderungen bei der Optimierung der Bildgebung.
Ein besseres Verständnis für die strukturelle und biologische Veränderungen im Gehirn entstehen in Abhängigkeit von verschiedenen Pathologien, und therapeutischen Maßnahmen sind zur Verbesserung Behandlungsstrategien. Allerdings ist eine der aktuellen Herausforderungen bei der Untersuchung dieser strukturelle und biologische Veränderungen, insbesondere in Bezug auf die intrakraniellen Pathologien ist die Unzugänglichkeit des Gewebes und die Unfähigkeit, die zeitliche Entwicklung und Progression von dynamischen Veränderungen di einem in vivo Einstellung zu studieren. Die Generation der "Fenster"-Technologie hat bereits bewiesen, bei der Prüfung der Weichgewebe durch Änderungen Tumorentwicklung 5-7 erfolgreich. Entwicklung der ICW Modelle erweist sich als technisch anspruchsvoll, aufgrund der Notwendigkeit, die Schädelknochen ohne Beschädigung auf Anstiftung Infektion in der zugrunde liegenden zerebralen Gewebe zu entfernen. Zurück Papiere haben versucht, den Schädel, um das Gewebe zu visualisieren 8-10 jedoch dünn, um eine hohe Auflösung im klaren produzierenAlter vollständige Entfernung des Schädelknochens wird 11 erforderlich. Wiederholen langfristige Bildgebung (30 Tage +) hat erst vor kurzem eine mögliche Option durch bildgebende 1,11 geworden, haben kürzere Zeitrahmen wurde 5 untersucht.
Während des letzten Jahrzehnts ein wichtiges Ziel war es, die Herkunft des neo-Gefäßsystem folgenden pathologischen Stimuli aufzuklären, insbesondere in Reaktion auf die Tumorbildung und Progression, um neue therapeutische Targets für die Behandlung von Tumoren bieten. Viel Streit bleibt rund um die Quelle für neue Blutgefäße im Gehirn während der Tumorentwicklung oder folgenden Strahlung. Traditionell Vaskularisierung ist betrachtet worden, durch Angiogenese, ein Prozess, durch den neue Gefäße bilden aus dem Sprießen von bereits vorhandenen Gefäßen 12 auftreten. Neuere Untersuchungen deuten jedoch darauf hin, dass der bisher angenommen embryonalen Prozess der Vaskulogenese spielen möglicherweise eine wichtige Rolle in der Bildung von pathologischen Gefäßsystem. Vasculogenesis beinhaltet die Einstellung der erwachsenen Angioblasten Kollegen aus dem Knochenmark, die dann wiederum direkt in die Bildung neuer Gefäßendothel 12-14 beteiligt. Immer mehr deutet darauf hinweisen, dass endotheliale Vorläuferzellen aus dem Knochenmark mobilisiert werden, um de novo Gefäßneubildung in Reaktion auf onkogenen Mediatoren 15-17 einzuleiten. Allerdings bieten diese Studien widersprüchliche Aussagen zur direkten Beitrag dieser Knochenmark stammende Zellen (BMDCs) an Gefäßendothel mit prozentuale Anteil variiert mit der Art der Anregung und pathologische Reaktion auf die Behandlung 18-21.
Daher Gründung reproduzierbare experimentelle Methoden, die hochauflösende Bildgebung intravital ermöglichen wiederholt Langzeitstudie des Prozesses der Integration in BMDC Tumorvaskulatur und in Reaktion auf die Therapie ist von unschätzbarem Wert. Standard-histologische Techniken versagen, um die dynamische Informationen liefernmationen erforderlich, um die langfristige Überleben, die Differenzierung und Integration der Zellen, die zu neovasculature geben und kann daher nicht eindeutig nachweisen, die Mechanismen der Zell-Interaktion zu bestimmen.
Wir haben gezeigt, mit unserem experimentellen Ansatz, dass es einen unterschiedlichen Grad der BMDC Rekrutierung sowohl nach intrakraniellen ionisierender Strahlung und Tumorwachstum, eine Einstellung, die jedoch, Pathologie ortsspezifische und nicht eine Invasion des gesamten intrakraniellen Gewebe 11,22. Wir haben gezeigt, dass die Einstellung eine zeitkritische Muster durch die wiederholte Abbildung eines einzelnen Tieres 11,22 gezeigt, folgt. In ähnlicher Weise kann in-vivo-Bildgebung auch wertvolle Einblicke in die Tumorzelle Mimikry wobei fluoreszierend markierten Tumorzellen abgebildet und mit einem intra-vital CD31 Antikörper für Endothelzellen verfolgt werden, um die Möglichkeit von Tumorzellen transdifferentiation um direkt eine eigene Endothel zu markieren.
<pclass = "jove_content"> Die Vielseitigkeit des Modells wird durch die Fähigkeit, Bild 4 fluoreszierenden Kanäle erweitert, eine erschöpfende Anzahl der Kombinationen für das Studium der unterschiedlichen zellulären und biologischer Prozess. Wir sind in der Lage, intravital Bild CFP (blau), GFP (grün), Kirsche / RFP (rot) und Alexa647/APC (weit-rot), gleichzeitig in einem einzigen Feld wiederholt über die Zeit. Forscher können genetisch zu verändern Zellen Fluorochrome für jeden der Kanäle sowie Kauf Farbstoffe und Antikörper ausdrücken zu strukturellen Veränderungen von besonderem Interesse hervorzuheben. Um Farbstoffe und Antikörper häufig in Studien verwendet Bisher gehören CD31 und Dextran die beide das Highlight Mikrovaskulatur und ihre Veränderungen im Gewebe 1,11,23,24, obwohl wir die weit-roten Kanal für diesen Zweck verwendet sowohl für den Einsatz in der anderen sind Kanäle erwähnt. Ebenso haben andere Farbstoffe einschließlich Sytox Orange, welche Bereiche der Apoptose Highlight wird und Marker, wie sie von der Firma Visen, wurde specifically zur Verwendung in vivo bestimmt. Zusätzlich zu den vier üblichen Fluoreszenzkanälen erwähnt, kann eine Erzeugung einer zweiten Harmonischen (SHG) Kanal aufgenommen und optimiert werden, um die endogenen Bild Kollagenfasern des Modells 7, Visualisierung der Basalmembran umgibt Gefäßsystem.Um die Anpassungsfähigkeit unseres Modells, sowie die Zell-Zell-Interaktionen erwähnt zu demonstrieren, haben wir in der Lage, Arzneimittel-Zell-Interaktionen zu studieren. Wir haben bei Drogen-Inhibitoren wie AMD3100 eine SDF-1 Inhibitor, und seine Rolle bei der Signalisierung Netzwerke in der Personalbeschaffung BMDC 11 beteiligt sah. Ebenso haben wir genetisch heraus U87 Gliom Xenotransplantate Zellen entwickelt, um VEGFTrap, ein VEGF Inhibitor 25, in Verbindung auszudrücken durch eine IRES GFP zu einem Molekül. Durch die Verwendung von RFP + BM sind wir in der Lage, die Rolle VEGF hat sich auf die Rekrutierung von BMDCs dem Gefäßsystem zu studieren. Vor kurzem haben wir das Modell auf Drogen untersuchen Kinetik genutzt Blick auf die mechanism hinter dem Tumor-Medikament Abgrenzung Fluorescein 26, auf zellulärer Ebene. Durch den Einsatz von einem speziell angefertigten Haus in Kleintier-Strahler konnten wir stereotaktische geliefert Strahlung zu integrieren, um die Reaktion des Tumors und BMDCs sowohl auf die Behandlung zu beurteilen haben.
Durch den Einsatz unseres neuartigen intravital Bildgebungsverfahren Forscher Einblick in die Single-Cell-Änderungen in Echtzeit, die in verschiedenen Pathologien und Systemen auftreten gewinnen, Unterstützung der Aufklärung der vielen funktionellen und biologischen Eigenschaften von Gewebeveränderungen.
Die drei Kanäle in allen Bildern bisher beschriebenen drei Marker von Interesse in anderen Modellen und Blätter Forscher eine unschätzbare Sammlung von Tools, um eine Vielzahl von Zelltypen und Wechselwirkungen aussehen austauschbar. Planung ist erforderlich, um sicherzustellen, dass alle Markierungen und Zelltypen haben erfolgreich eine Reporterfluoreszenz Molekül in einem gesonderten Kanal integriert.
Zusätzlich zu den Standard-drei Kanäle verwendet hier waren wir auch in der Lage zu integrieren einen vierten Kanal CFP (4A) und eine SHG basierten Kollagen Kanal 7 (4B). Dadurch erhöht sich die Möglichkeit der Blick auf zelluläre Interaktionen in vivo und erlaubt zusätzlich die Benutzer verpflichten Bevölkerung Mischen auf bestimmte Zell-Zell-Interaktionen zu untersuchen unter Beibehaltung zwei Kanäle für andere Marker. Zum Beispiel haben wir bei Tumorzellen (RFP) und Krebs-Stammzellen (GFP) in einem Verhältnis von 1:3 mit einem Interesse an den Vergleich ihrer intratum sahmündliche Wechselwirkungen (Abbildung 4A). Wir beobachteten, dass 7 Tage nach der Implantation der gemischten Bevölkerung das Verhältnis gewahrt wurde und beide Zellpopulationen konnte noch gesehen werden.
Die GFP-Kanal bietet technische Probleme aufgrund der Überschneidung mit dem GFP-Kanal in beiden Anregungs-und Emissionsspektren und als solche erfordert Beitrag Bildverarbeitung, um die wahre GFP + Zellen von denen, die eigentlich GFP + definieren. Beitrag Bildverarbeitung heraus kann auf der 2-Photonen-Mikroskope in Zeiss LSM Software direkt wodurch gebaut durchgeführt werden, wird die GFP Bild von der GFP Bild was den wahren GFP Zellen hinter (4A) links abgezogen. Die Prämisse für das Verhältnis Subtraktion abhängig ist ebenso helle Bilder und ist aufgrund der GFP-Laser (458 nm) fluoreszieren sowohl GFP und GFP-Zellen, während die GFP-Laser (488 nm) ist zu hoch, um die GFP fluoresziert Zellen. Neben CFP haben wir auch in der Lage, bereits veröffentlichten Setups verwenden, um bei der SHG aussehenEbenen und so zeigen die Kollagenfasern, aus denen sich die Basalmembran umgibt Gefäßsystem (4B).
Eine weitere Anpassung dieses Modells hat den Vorteil einer speziell angefertigten Kleintier-Strahler, die die Fähigkeit zur stereotaktischen geführte Strahlung zu verwenden, um Abschnitte des Gewebes so gering wie 2 mm im Durchmesser hat bestrahlen gemacht. Durch die Ausrichtung des Fensters mit Bestrahlung ist es möglich, die Wirkung Strahlung auf das darunter liegende Gewebe zu sehen. Wir haben kürzlich eine Studie veröffentlicht, Blick auf die Wirkung Strahlung auf normalem Hirngewebe in Bezug auf die Rekrutierung von BMDCs auf das Gefäßsystem, die sich speziell an ihre Rolle beim Strahlung Gewebeveränderungen. Wir fanden, dass die Rekrutierung der BMDCs Zeit und dosisabhängig in normalem Gewebe 11 war.
Es ist möglich, die Mechanismen der Lieferung und Integration von Therapeutika Bereitstellung der Studienmedikation mit einem fluoreszierenden Marker markiert. Währendunserer Forschung ist es uns gelungen, die Produktion von VEGFTrap, ein Anti-Angiogenese-Medikament, das alle VEGF Signalisierungsblöcken im lokalen Bereich der Produktion 25 zu verfolgen. Durch gentechnisch veränderte unsere Tumorzellen, die VEGFtrap Gen mit einem IRES zu EGFP gekoppelt (Abbildung 4CI) auszudrücken und mit RFP "Spender" BM konnten wir das Bild EGFP: VEGFtrap Produktion, BMDC Interaktion und Gefäßsystem gleichzeitig (Abbildung 4Cii). Dies zeigte die Vielseitigkeit des Modells und Kanäle zur Verfügung. Es ist auch möglich, auf die Kinetik des Medikaments aufgrund der Versprechen der Single-Cell-Auflösung anschauen. Fluorescein (GFP +) wird verwendet, um Tumoren während der Operation zu beschreiben, um sicherzustellen, maximal Resektion 26 erreicht. Durch die Injektion intravenös während Bildgebung ist es möglich zu zeigen, dass die Abgrenzung NICHT erfolgt durch die aktive Aufnahme des Fluorescein in die Tumorzellen selbst, sondern durch die Sammlung des Medikaments in den Stromazellen mit time, durch den Mangel an Co-Lokalisation 10 min nach der Injektion der Fluorescein (4D) zu sehen.
Insgesamt vereint neuartige Strategie die vorhandenen Verfahren, um eine einzigartige experimentelle Plattform, die vorteilhaft bei der Untersuchung von dynamischen zellulären Interaktionen zu erreichen. Diese Strategie hat sich als eine unschätzbare Ansatz für die Prüfung hochauflösende Single-Cell-dynamischen Entwicklung BMDC, Tumor-und normalem Gehirn Durchblutung in Ansprechen auf die Therapie, intrakranial sein. Intravital Bildgebung kann zu einem besseren Verständnis der molekularen Regulatoren der BMDC Rekrutierung, Migration und Differenzierung in intrakraniellen Hirntumor Gefäßsystem sowie viele andere dynamische Prozesse anpassbar an anderen Forschungsbereichen. Hemmung putative Faktoren, BMDC in Kombination mit anderen therapeutischen Regulierung Strategien helfen die Identifikation der genaue Zeitpunkt der Kombinationstherapien. Darüber hinaus kann diese Strategie auf viele weitere pr angepasst werdenojekte Verwendung nicht nur in vivo intravital Färbung Farbstoffen, aber auch kleine molekulare Inhibitoren und Nanopartikel, die fluoreszenzmarkierten werden so dass die Forscher die Verteilung und Migration Muster von gezielten Therapeutika sowie längs Blick auf ihre Kinetik zu verfolgen.
The authors have nothing to disclose.
Wir würden gerne die Advanced Optical Microscopy Facility am der Prinzessin Margaret Krankenhaus danken, insbesondere James Jonkman für ihre Unterstützung bei der Ersteinrichtung der Kanäle auf der 2Photon Mikroskop. Die Autoren bedanken sich bei der räumlich-zeitlichen Targeting und Amplifikation von Strahlung Response (STTARR) Programm und seine verbundenen Förderorganisationen anzuerkennen. Wir danken Dr. Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael und Dr.Andras Nagy für die Versorgung der VEGFTrap Plasmiden und für ihr Manuskript Korrekturen und Feedback. Die kontinuierliche Unterstützung und Diskussion über das Personal des BTRC ist von unschätzbarem Wert, und wir möchten Dr.Abhijit Guha für seine wissenschaftlichen Input zu gedenken. Die Arbeit wurde durch CIHR und NIH Zuschüsse finanziert.
Reagent | |||
NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
Equipment | |||
Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
22G Needle | BD | 305156 | |
27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI |