소설 고해상도<em> 생체 내</em종양의 성장과 치료학에 두개 내 구조물의 동적 응답을 공부하기> 이미징 기술
Summary
우리는 소설을 설명<em> 생체 내</em> 이미징 기술이 두개 창문과 높은 해상도의 2 광자 현미경 커플 형광 키메라 생쥐. 이 영상 플랫폼 에이즈 병적 인 모욕에 따라 단일 셀 수준에서 뇌 조직과 미세 혈관의 동적 변경, 연구하고 두개 약물 전달 및 유통을 평가에 적용됩니다.
Abstract
우리는 성공적으로 통합 이전 intracranially 조직 구조 변화의 직접적인 장기적으로 시각화 할 수있는 새로운 플랫폼을 개발하는 intravital 2 광자 공 초점 현미경을 두개 창 (ICW) 기술 1-4를 설립했다. 실시간 방식으로 단일 셀 해상도의 영상은 조직의 '스냅 샷'크로스 섹션에서 유일하게 보이는 표준 엔드 포인트 학적 분석에서 제공하는 이외의 보충 동적 정보를 제공합니다.
형광 키메라 생쥐에서이 intravital 이미징 기술을 확립, 우리는 동시에 이미지 네 개의 형광 채널을 수 있습니다. 같은 GFP와 같은 + 골수 통합 찬란 세포에 의해, 조직 내에서 자신의 장기 마이그레이션, 통합 및 차별화를 공부 이러한 세포의 운명을 추적 할 수 있습니다. 이러한 mCherry 신경 교종 종양 라인으로 차 기자 셀의 추가 통합 charac 수 있습니다세포 상호 작용 : 세포의 terization. 조직의 미세 구조적 변화는 예를 들어 CD31 태그 항체와 덱스 트란 분자, 내 생명 염료와 항체의 추가를 통해 강조 할 수 있습니다.
더욱이, 우리는 이온화 방사선 투여 후 발생하는 역동적 인 조직 변화를 평가 할 수있는을 통해 플랫폼을 만들고, 정위 방사선을 제공하는 작은 동물 마이크로 조사기 우리의 ICW 이미징 모델의 조합을 설명합니다.
우리 모델의 현재의 한계는 뇌의 등쪽 축에 이미징을 제한, 하위 대뇌 피질의 표면에서 900 μM까지의 깊이로 제한됩니다 현미경의 투과도 있습니다. 두개골 뼈의 존재는 현재 유방 조직과 지방 패드 5-7을 연구하는 데 더 설립 활용 챔버 모델에 비해, ICW 좀 더 도전적인 기술적 인 절차를합니다. 또한, ICW PROVIDE에서 많은 도전 영상을 최적화.
Introduction
각종 병리에 대한 응답으로 뇌의 발생 구조 및 생물 학적 변화 및 치료 개입의 더 나은 이해는 치료 전략 개선을위한 중요합니다. 그러나 특히 두개 내 병변에 대한 이러한 구조 및 생물 학적 변화를 연구의 현재 과제 중 하나는 조직의 어려움과 시간적 진화와 생체 설정의 변경을 동적으로 진행을 연구하는 무능력이다. "창"기술의 세대는 이전 5-7 종양의 개발을 통해 연부 조직의 변화를 조사 성공적으로 입증했다. ICW 모델의 개발은 기술적으로 더 어려운, 기본 뇌 조직에 감염을 선동에 손상없이 두개골 뼈를 제거하는 필요에 의한 것으로 증명한다. 이전 논문 고해상도 명확한 메신저를 생산하는, 그러나 조직 8-10 시각화 두개골을 얇게하려고했습니다두개골 뼈의 나이를 완전 제거가 11이 필요합니다. 장기 영상 (30 일 +)는 최근에 영상 1,11 통해 가능한 옵션이되고있다 반복 이전에 짧은 시간 프레임은 5를 공부하고 있습니다.
지난 10 년간의 주요 목표는 종양의 치료에 대한 새로운 치료 표적을 제공하기 위해, 종양 형성과 진행 님의 질문에 답변 특히, 신 혈관 다음과 같은 병적 인 자극의 기원을 해명하는 것이 었습니다. 많은 논란이 종양 발달 또는 다음 방사선 동안 뇌에서 새로운 혈관의 근원 주위에 남아있다. 전통적으로 혈관은 혈관 신생, 새로운 혈관이 기존 선박 12의 발아에서 형성하는 과정을 통해 발생하는 것으로 간주되었다. 최근의 연구는 그러나 vasculogenesis 이전에 가정 배아 프로세스가 병적 인 혈관의 형성에 더 중요한 역할을 할 수 있습니다하는 것이 좋습니다. 버지니아의sculogenesis 차례로 누른 다음 바로 새로운 혈관 내피 12-14의 형성에 관여하는 골수에서 성인 angioblast 대응의 채용을 포함한다. 증거를 축적하는 내피 전구 세포가 종양 매개 15-17 님의 질문에 새로이 혈관 형성을 시작하기 위해 골수에서 동원을 나타냅니다. 그러나, 이러한 연구 결과는 병적 인 자극과 치료에 18-21에 대한 응답의 종류에 다양한 기여 비율과 혈관 내피 세포에 이러한 골수 유래 세포의 직접적인 기여 (BMDCs)에 대한 모순 된 증거를 제공합니다.
따라서 종양의 혈관에와 치료 님의 질문에 답변 BMDC 통합 과정의 반복 장기 연구 고해상도 intravital 이미징을 허용 재현 실험 방법을 확립하는 것은 매우 유용합니다. 표준 조직 학적 기술은 동적 INFOR을 제공하지mation은 neovasculature을 야기하기 때문에 결정적으로 세포 상호 작용의 메커니즘을 설명 할 수 세포의 장기 생존, 분화 및 통합을 결정해야합니다.
우리는 두개 이온화 방사선 및 종양의 성장을 모두 다음 BMDC 모집의 변화 정도, 그러나 인 채용, 병리 특정 사이트가 아닌 전체 두개 내 조직 11,22의 침공이 우리의 실험 방법을 사용하여 보여 주었다. 우리는 모집 한 동물 11,22의 반복 영상으로 시연 시간에 민감한 패턴을 따르는 것으로 나타났습니다. 찬란 태그 종양 세포가 직접 자신의 내피 세포를 형성하는 종양 세포 분화의 가능성을 강조하기 위해 내피 세포 내 중요한 CD31 항체 군데 추적 할 수 있습니다 약자 마찬가지로 생체 내 이미징 또한 종양 세포의 흉내에 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
<p클래스 = "jove_content"> 모델의 다양성은 세포 및 생물 학적 과정에 변화를 연구 조합의 철저한 번호를 제공, 이미지 4 형광 채널의 능력에 의해 향상됩니다. 우리는 동시에 시간이 지남에 따라 반복적으로 단일 필드에 intravitally 이미지 CFP (파란색), GFP (녹색), 체리 / RFP (빨강) 및 Alexa647/APC (원적외선) 할 수 있습니다. 연구팀은 유전자 특정 관심의 구조적 변화를 강조 채널뿐만 아니라 구매 염료 및 항체의 각 형광체를 표현하는 세포를 수정할 수 있습니다. 일반적으로 연구에 사용 염료와 항체를 업데이트하려면 CD31 및 덱스 트란을 포함하는 두 하이라이트 우리는이 목적을 위해 멀리 빨강 채널을 활용하지만 모두가 다른에서 사용할 수있는 미세 혈관과 조직 1,11,23,24에서의 변화 채널 언급했다. 마찬가지로, SYTOX 세포 사멸의 영역을 강조 할 오렌지,, 그리고 회사 Visen에서 그와 같은 마커를 포함한 다른 염료, SPE되었습니다cifically 생체 내에서 사용하도록 설계되었습니다. 언급 된 네 가지 일반적으로 사용되는 형광 채널 또한, 두 번째 고조파 발생 (SHG) 채널을 추가 할 수 있으며, 혈관을 둘러싼 기저막을 시각화 이미지 모델 7 내생 콜라겐 섬유에 최적화되어 있습니다.우리 모델의 적응성뿐만 아니라, 위에서 언급 한 세포 – 세포 상호 작용을 설명하기 위해, 우리는 약물 세포 상호 작용을 연구 할 수 있었다. 우리는 AMD3100, SDF-1 억제제 및 BMDC 모집 11에 관련된 네트워크를 신호의 역할과 같은 약물 억제제를 살펴 보았다. 마찬가지로 우리는 유전자 GFP 분자에 IRES를 통해 함께 VEGFTrap, VEGF 억제제 25를 표현하는 U87 신경 교종 이종 이식 세포 밖으로 설계했다. RFP + BM을 사용하여 우리는 VEGF가 혈관에 BMDCs의 채용에 미치는 역할을 연구 할 수 있습니다. 가장 최근에 우리는 MEC에서 찾고 약물 동력학을 연구하는 모델을 활용 한세포 수준에서 종양의 윤곽을 약 형광 26 일 뒤에 hanism. 의 사용을 통해 사용자 정의 – 기본 우리가 치료에 종양 BMDCs 모두의 반응을 평가하기 위해 정위 전달 방사선을 통합 할 수있게되었습니다 집 작은 동물 조사기합니다.
우리의 새로운 intravital 이미징 방법을 연구자의 사용을 통해 조직 변화의 많은 기능 및 생물 학적 기능의 해명을 돕고, 각종 병리 및 시스템에서 발생하는 단일 셀의 실시간 변화에 대한 통찰력을 얻게 될 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모든 이미지에 설명 된 세 개의 채널은 지금까지 수많은 종류의 세포와 상호 작용을 볼 수있는 도구의 귀중한 세트를 다른 모델과 잎 연구자의 관심 개의 마커 교환 할 수있다. 계획은 모든 마커와 세포 유형이 성공적으로 별개의 채널 리포터 형광 분자를 통합했습니다 확인하는 데 필요합니다.
여기에 사용되는 표준 3 채널 외에 우리는 또한 네 번째 CFP 채널 (그림 4A)과 SHG 기반의 콜라겐 채널 7 (그림 4B)를 통합 할 수 있었다.이 생체 내에서와뿐만 아니라 세포의 상호 작용보고의 가능성을 확장 할 수 있습니다 사용자가 다른 마커 두 채널을 유지하면서 특정 세포 – 세포 상호 작용을 연구하는 혼합 인구를 수행합니다. 예를 들어, 우리는 그들의 intratum 비교에 관심을 1:3 비율로 종양 세포 (RFP) 및 암 줄기 세포 (CFP)에서 보았다구두 상호 작용 (그림 4A). 우리는 혼합 인구의 7 일 후 주입이 비율이 확정 된 두 세포 집단은 여전히 볼 수있다 것을 관찰했다.
CFP 채널 + 세포가 실제로 GFP +되는 것과 진정한 CFP을 정의하는 게시물 이미지 처리를 필요로 여기 및 발광 스펙트럼 모두와 같은 GFP 채널에 중복으로 인해 기술적 인 문제를 제공합니다. 글 이미징 처리 자이스 혈구 LSM 소프트웨어를 직접 그것에 내장 된 2 광자 현미경에서 수행 할 수 GFP 이미지는 (그림 4A) 남아되는 진정한 CFP 세포에서 발생 CFP 이미지에서 뺍니다. 비 공제의 전제는 동일하게 밝은 이미지에 의존하고 GFP 레이저 (488 nm의) 반면 CFP와 GFP 세포를 모두 형광 CFP 레이저 (458 nm의)에 의한 CFP 세포를 형광 너무 높다. CFP뿐만 아니라 우리는 또한 SHG보고 이전에 출판 된 설정을 사용할 수있게되었습니다수준 등 혈관을 둘러싼 기저막 (그림 4B)를 구성하는 콜라겐 섬유를 묘사.
이 모델의 또 다른 적응 직경 2mm처럼 작은 조직의 섹션을 조사하는 정위 유도 방사선을 사용하는 능력을 가지고 사용자 정의 내장 된 작은 동물 조사기의 장점을 취했습니다. 조사에 창을 대상으로 그것에는 기본 조직에 영향 방사선에 볼 수 있습니다. 우리는 최근 효과 방사선을보고 연구를 발표 한 혈관에 BMDCs의 채용과 관련하여 정상 뇌 조직에 있으며, 게시물 방사선 조직 변화의 역할에 특별히 찾고. 우리는 BMDCs의 채용 시간과 정상 조직 11에 따라 용량을 모두 것으로 나타났습니다.
그것은 마약을 제공하는 치료의 전달과 통합의 메커니즘을 연구하기 위해 가능한 것은 형광 마커로 태그됩니다. 시우리의 연구는 우리가 VEGFTrap의 생산, 생산 25의 지역에있는 모든 VEGF 신호를 차단 항 혈관 약을 추적 할 수 있었다. VEGFtrap 생산 BMDC 상호 작용과 동시에 혈관 (그림 4Cii) : 유전자 EGFP에 IRES와 결합 VEGFtrap 유전자 (그림 4Ci)를 표현하기 위해 종양 세포를 수정하고 RFP '기증자'BM을 사용하여 우리는 이미지 EGFP를 할 수 있었다. 이 모델과 사용 가능한 채널의 다양성을 보여 주었다. 그것은 단일 셀 해상도의 약속으로 인해 약물 동력학 보는 것도 가능하다. 형광 (GFP +)는 최대한 절제는 26 달성하기 위해 수술 중에 종양을 묘사하는 데 사용됩니다. 정맥 동안 영상을 주입하여 그 묘사가 종양 세포 자체에 형광의 적극적인 이해를 통해 NOT 발생하는 것을 입증 할 수 있지만 대신 약물의 컬렉션을 통해 T와 기질 영역에형광 (그림 4D)의 주입에 따라 공동 현지화 10 분의 부족에 의해 볼 IME.
전반적으로 우리의 전략은 동적 세포 상호 작용의 연구에 유리한 독특한 실험 플랫폼을 달성하기 위해 소설과 기존 기술을 결합합니다. 이 전략은 intracranially, 치료에 반응 BMDC, 종양과 정상 뇌 혈류의 고해상도 단일 셀 동적 변화를 조사하기위한 매우 중요한 방법이 될 입증되었습니다. Intravital 이미징 BMDC 채용, 이동 및 분화 두개 내 뇌 종양 혈관에서뿐만 아니라 다른 연구 분야에 적용 할 수 많은 다른 동적 프로세스의 분자 규제의 더 나은 이해를 제공 할 수 있습니다. 다른 치료 전략과 함께 BMDC을 조절 억제 추정 계수는 조합 치료의 정확한 타이밍의 식별 도움이 될 수 있습니다. 또한이 전략은 많은 미래의 홍보에 적용 할 수 있습니다생체 intravital 염색 염료에서뿐만 아니라 활용,뿐만 아니라 작은 분자 억제제 찬란 연구자뿐만 아니라 자신의 반응 속도에 세로 방향으로 보면 더 많은 표적 치료제의 유통 및 이동 패턴을 추적 할 수 있도록 태그 나노 입자 객체들의.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 2Photon 현미경의 채널의 초기 설정에서 자신의 도움을 특히 제임스 Jonkman에, 마가렛 공주 병원에서 고급 광학 현미경 시설을 감사하고 싶습니다. 저자는 방사선 응답 (STTARR) 프로그램 및 계열사 자금 지원 기관의 시공간적 타겟팅 및 증폭을 인정하고 싶습니다. 우리는 VEGFTrap 플라스미드를 공급하고 그들의 원고 수정 및 피드백 박사 피터 Tonge, Dr.Iacovos 마이클과 Dr.Andras 나기 감사합니다. BTRC 직원의 지속적인 지원과 논의 소중한되고 우리는 그의 과학적 입력 Dr.Abhijit Guha을 기념하고 싶습니다. 작품은 CIHR와 NIH 교부금에 의해 투자되었다.
Materials
| Reagent | |||
| NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
| B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
| ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
| Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
| 2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
| 10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
| CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
| AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
| Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
| Equipment | |||
| Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
| Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
| 22G Needle | BD | 305156 | |
| 27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
| Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| 2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
| 10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
| Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
| Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
| Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
| Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI |
Riferimenti
- Kienast, Y. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).
- Holtmaat, A. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation. Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).
- Kherlopian, A. R., et al. A review of imaging techniques for systems biology. BMC Systems Biology. 2, 74 (2008).
- Kedrin, D. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Perentes, J. Y., et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nature Methods. 6, 143-145 (2009).
- Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).
- Marker, D. F., Tremblay, M. -. E., Lu, S. -. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
- Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).
- Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation. PLoS ONE. 7, e38366 (2012).
- Tate, M. C., Aghi, M. K. Biology of angiogenesis and invasion in glioma. NURT. 6, 447-457 (2009).
- Aghi, M., Chiocca, E. A. Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors. Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).
- Nussenbaum, F., Herman, I. M. Tumor angiogenesis: insights and innovations. J. Oncol. 2010, 132641 (2010).
- Zhang, H. -. r. Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft. J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).
- Du, R., et al. HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).
- Rajantie, I. Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells. Blood. 104, 2084-2086 (2004).
- Shin de Patil, V. R., et al. marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma. Neoplasia. 7, 234-240 (2005).
- Purhonen, S. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).
- Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes. Ricerca sul cancro. 66, 9054-9064 (2006).
- Burrell, K., Zadeh, G. . Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , (2012).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Tolentino, M. J., et al. Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization. Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).
- Holash, J. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).
- Shinoda, J., et al. Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium. , 1-7 (2003).
