TruTipは、多孔質モノリシック結合マトリックスがピペットチップ内に挿入される単純な核酸抽出技術である。これにより、試料調製フォーマットは、ほとんどの液体ハンドリング機器と互換性があり、高スループットの臨床応用およびサンプルタイプに多くの媒体を用いることができる。
TruTipは、多孔質モノリシック結合マトリックスがピペットチップ内に挿入される単純な核酸抽出技術である。モノリスの形状は、1.0から5.0ミリリットルにボリュームの範囲の特定のピペットチップに適合させることができる。モノリスの大気孔率は容易に最小限の流体の背圧でそれを通過する粘性または複雑なサンプルを有効にします。双方向フローは、モノリスと試料との間の滞留時間を最大化し、単一TruTip内で処理すべき大量の試料を可能にする。かかわらず、サンプルボリュームまたはTruTipジオメトリの基本的な手順は、細胞溶解、TruTipモノリスの内側の孔に結合核酸、結合していない試料成分と溶解緩衝液を洗い流し、適切な緩衝液中に精製し、濃縮した核酸を溶出するが含まれています。 TruTipの属性と適応はエッペンドルフepMotion 5070を使用して、3つの自動化された臨床サンプル処理プロトコルで実証されている鼻咽頭吸引液からRNAの単離、全血からのゲノムDNAの分離、及び母体血漿(それぞれ)の大ボリュームから胎児のDNA抽出と濃縮を含め、ハミルトンSTARとSTARplus液体ハンドリングロボット、。
核酸精製は、のみを使用し、ほとんどの研究分子診断のために必要であり、ライフサイエンスアプリケーション。様々なアプローチが、その多くは、カオトロピック塩1の存在下でシリカに結合する核酸の基本的な原理に基づいており、フェノール/クロロホルム抽出の時から浮上している。抽出プロセスは、(2-13に例を参照)、スピンフィルタ、磁気ビーズおよびライフサイエンス業界を支配して関連するアプローチで、様々なビーズとメンブレンベースの形式を使用することにより合理化および自動化されています。効果的で挑戦的な臨床行列に直面したとき、粒子と膜は限界を知っていた。例えば、膜およびビーズベースの列が対応し、小孔サイズを(従って、高い背圧)があり、遠心分離または真空システムによって処理されるために、支持体のいくつかのタイプを必要とする。膜やビーズ列結果のの物理的特性効率的な消耗、及び/又は一方向流路を加工することができる合計(入力)サンプル量を詰まらせることなく処理することができる試料の種類を制限する重要な流体抵抗。逆に、磁性粒子は攪拌により試料全体に分散されている必要があります。均一溶液中に磁性粒子を分散させる必要が最も磁気ビーズ消耗品を使用して処理することができる総入力サンプル量を制限する。臨床サンプルの属性(例えば、粘度や複雑さなど)がチューブまたはロッドの側面に非効率的な磁気粒子濃度につながることができます。また、シリカ微粒子は、その磁化を失い、最終サンプルを汚染する、抽出プロセス中にビーズのオフに破ることができる。
TruTip技術は、これらの核酸試料処理の制約および制限14のいくつかを克服するために開発された。多孔質モノリス内に埋め込むことによりピペットチップは、流体の背圧が低下し、真空下( すなわち、ピペット吸引)による流量制御を可能にする。この機能は、大幅に簡素化することが困難な試料タイプ( 図1)から核酸を精製するために必要な抽出処理および計装を可能にする。モノリスのジオメトリと気孔率はモノリスの厚さは1.0から5.0ミリリットルまでのサンプル量に十分な核酸結合容量を提供しながら、目詰まりを最小限にするために調整されています。検体吸引分注時の双方向の流れがサンプル抽出かつ効率的な核酸の回収および溶出に対する結合モノリスとの間の延長された滞留時間を可能にし、ピペットチップ自体の体積容量を超えること処理される比較的大きな試料体積を可能にする。我々は以前に、シングルまたはマルチチャネルライを使用して、鼻咽頭サンプルからインフルエンザRNAを精製するための手動TruTip手順の開発と応用が報告され忍ピペッター15。同等の抽出効率が10 6遺伝子コピーで自動QIAcubeと手動TruTipメソッド間インフルエンザ当たりミリリットル鼻咽頭吸引液を得た。本研究の目的は、一般的に基準臨床検査で見つかった液体ハンドリングロボットを用いた鼻咽頭吸引(NPA)および他の臨床的に関連するサンプルタイプの中·高スループット自動化TruTip核酸の精製手順を実証することであった。
TruTipの概念およびワークフローの簡略化( 図1)、それは容易に適合させる、自動化された効率的および臨床サンプルマトリックス、入力サンプルボリューム、および液体ハンドリングシステムの数のために有効である。これは、すべての臨床試料が一意であることが認識されるべきであり、粘度、粒子状物質、粘液、表面汚染物質、微生物、および/またはヒトの遺伝的背景の次に1つを変化するであろう。臨床試料組成物および自動TruTipサンプル調製プロトコルの利用目的の予想ばらつきを考えると、それは、したがって、特定のサンプルの種類の所望の結果を達成するために、TruTip手順における特定のステップを修正する必要があるかもしれない。かかわらず、サンプルタイプの、しかし、典型的に核酸の純度及び/又は回収に最も大きな影響を及ぼすTruTipパラメータがあります。
ロボットアームチャネルに幾何学、ピペットチップ材料、及び取り付け方法は、各機器メーカー一意であるため、異なるTruTip構築物は、それぞれの液体ハンドリングシステムのために必要とされる。 TruTipモノリス寸法(直径、厚さ、孔径)は、核酸結合能(および溶出効率)と相関しない、などの任意の固相抽出技術が期待される。厚い(> 4 mm)の行列は、大容量のサンプルのための核酸結合容量を増加および/または特定のTruTip形式を横切る結合容量が等しくなるように、1mlのTruTipに埋め込まれてもよいが、TruTipの厚さとの間の流量との間にトレードオフが存在する初期結合工程(粗溶解の存在下で)。従って、それは( 例えば<、自動化されたプロトコルの最初のステップのための大ボリュームピペットチップに大径のモノリスを埋め込 むことが時として有利で ある/ em>の大容量抽出のために5ミリリットルハミルトン/ Akonni TruTips)。リキッドハンドリングロボットの製造業者によって規定特定TruTip構成を考えると、しかし、我々は、必ずしもTruTip核酸利回りは異なるメーカーの、または異なるTruTipサイズ渡るリキッドハンドリングプラットフォーム間で同一であることを期待しないでください。
彼らは通常は無菌の部位( 例えば脳脊髄液)から取得していない限り、臨床検体は(定義により)ヒトゲノムDNAのかなりの量が含まれます。他のアプリケーションで不要なヒトDNAゲノムの背景( 図5のような)を表す一方、時にはヒトゲノムDNAは、( 図6のように)が望まれている。バックグラウンドDNAの存在は、通常モノリスの結合容量を超えない試料中の核酸の総量限り、問題とならない、背景DNAは、キャリアとして機能することができ、所望の標的核酸場合酸は微量で存在する。ことを除いて感染症検査の試料調製対物レンズに類似している大容量の血漿抽出プロトコール( 図7)母系DNAの10〜20倍過剰の存在下で(断片化)胎児DNAを単離すること、を目的配列は高度に合同であるとのみ特異性の高い分子検査および/またはサイズの差別によって区別することができます。この場合には、総循環DNAを5mlのTruTipを用いて単離し、高分子続くと低分子量の胎児DNAを、結合バッファー条件を変えることによって、1mlのTruTipに後続の結合および溶出を介して分離される。シリカモノリスへの結合および溶出特性に基づいて標的核酸の選択的なサイズ分離と濃縮は、膜またはサイズ排除スピンカラムによって達成さよりも有意に異なる作用機モードである。ヒトゲノムDNAからサイズ分離と微生物のDNAの濃縮は、かもしれないカスタマイズTruTip結合および溶出バッファーを経由して、将来のアプリケーションでccomplished。
自動化されたプロトコルは、多様な臨床サンプル、そしてそれがどのように大規模なボリュームと特定の液体ハンドリングロボットに適合させることができるを処理するためTruTipモノリス自体の有用性を強調してここに示しました。合理化された方法は、典型的には他の自動化システムと比較してより高速な抽出プロトコールをもたらす。 TruTip手続きを自動化するために必要な主要なハードウェアはピペットチャンネルアーム自体ではなく、磁気棒、真空システムであるため、TruTip技術のシンプルさは、しかし、また、新しい、自動化された核酸精製システムを購入に興味のある人のためのいくつかのコスト優位性を与える、または遠心分離機オンボード。予め充填された試薬プレートを利用することも領域と必要な消耗を低減し、走行あたりのスループットを倍増できる。 TruTipプロトコルでデッキスペースを最小限に抑えることも、上流またはdを統合する上級ユーザーを可能にするTruTipとownstream自動化されたプロセス。例えば分別全血にハミルトンのeasyBloodソリューションが大幅にバイオバンキングプロセスを合理化したい自動TruTip抽出方法で組み込むことができます。このような核酸定量、正規化、PCRをセットアップ、またはDNA配列としてポスト抽出プロセスも容易に大きくリキッドハンドリングプラットフォーム上TruTipに統合されています。
The authors have nothing to disclose.
この作業の一部は助成R 44 AI072784下国立衛生研究所(NIH)によってサポートされていました。我々は博士キルスティンセントジョージ、サラB. Griesemer、ダリルラムソンとウイルス病研究室のエイミー·ディーン、定量インフルエンザビリオンと臨床的に検証されインフルエンザへのアクセスをリアルタイム用ズワースセンター、ニューヨーク州保健部に感謝PCRアッセイ。
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |