Um Ensaio visual para o Monitor T6SS mediada Competição bacteriana
Summary
Descreve-se um ensaio qualitativo para monitorar competição bacteriana mediada pela<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Tipo de sistema de secreção VI (T6SS). O ensaio baseia-se na sobrevivência / morte de células de Escherichia coli que transportam um alvo<em> LacZ</em> Repórter. Esta técnica é ajustável para avaliar a actividade bactericida / bacteriostase de T6SS-proficientes microorganismos.
Abstract
Sistemas de secreção de tipo VI (T6SSs) são nanomáquinas moleculares que permitem bactérias Gram-negativas e para o transporte de proteínas para injectar uma ampla variedade de células de 1,2-alvo. O T6SS é composta por 13 componentes do núcleo e exibe semelhanças estruturais com a cauda de bacteriófagos tubo 3. O fago usa um tubo e um dispositivo de puncionar para penetrar o envelope celular das bactérias alvo e injectar o DNA. Propõe-se que o T6SS é um dispositivo de bacteriófago invertido criação de um caminho específico no envelope da célula bacteriana para dirigir efectores e toxinas para a superfície. O processo pode ser levado mais longe e o dispositivo pode perfurar T6SS outras células com as quais a bactéria estiver em contacto, assim injectar os efectores para estes alvos. O tubo de cauda e partes do dispositivo de punção dos T6SS são feitos com Hcp e proteínas VgrG, respectivamente 4,5.
A versatilidade do T6SS tem sido demonstrada através datudies usando vários patógenos bacterianos. Os T6SS Vibrio cholerae pode remodelar o citoesqueleto das células hospedeiras eucarióticas injectando uma "evoluiu" VgrG carregando uma actina C-terminal de ligação cruzada de domínio 6,7. Outro exemplo notável foi recentemente documentado usando Pseudomonas aeruginosa, que é capaz de atacar e eliminar as bactérias de uma maneira dependente da T6SS, promovendo assim o estabelecimento de bactérias em nichos microbianos específicos e ambiente competitivo 8,9,10.
Neste último caso, três T6SS-secretadas proteínas, ou seja, Tse1, Tse2 Tse3 e têm sido identificados como as toxinas injectados na bactéria alvo (figura 1). A célula do dador é protegido contra o efeito prejudicial destes efectores por meio de um mecanismo de anti-toxina, mediados pelas proteínas Tsi1, Tsi2 e Tsi3 imunidade 8,9,10. Esta actividade anti-microbiana pode ser monitorizado quando T6SS-proficientes bactérias são co-cultivados em sOlid superfícies em competição com outras espécies bacterianas ou com T6SS-inactivos bactérias da mesma espécie 8,11,12,13.
Os dados disponíveis enfatizou uma abordagem numérica para o ensaio de competição de bactérias, incluindo demorada contagem CFU que depende em grande parte responsáveis antibióticas. No caso de estirpes resistentes aos antibióticos, como P. aeruginosa, estes métodos podem ser inadequadas. Além disso, com a identificação de cerca de 200 diferentes loci T6SS em mais de 100 genomas bacterianos 14, uma ferramenta de rastreio conveniente é altamente desejável. Foi desenvolvido um ensaio que é fácil de utilizar e requer materiais e reagentes de laboratório padrão. O método oferece uma técnica rápida e qualitativa para monitorizar a actividade bactericida dependente do T6SS / bacteriostase usando uma estirpe repórter como presa (neste caso, a Escherichia coli DH5a), permitindo uma complementação do gene lacZ. No geral, este método é graphic e permite a rápida identificação de fenótipos relacionados T6SS em placas de agar. Este protocolo experimental pode ser adaptado para outras estirpes ou espécies bacterianas, tomando em consideração as condições específicas, tais como meios de crescimento, a temperatura ou o tempo de contacto.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método apresentado neste artigo permite uma observação visual de T6SS mediada atividade bactericida / bacteriostase. O ensaio é efectuado sobre a superfície de uma placa de agar. Foi previamente demonstrado que T6SS dependente de ensaio realizado com matança cultura bacteriana mista líquido não é eficaz, provavelmente devido à falta de contacto constante entre as duas bactérias 8. O T6SS é acreditado para operar com um mecanismo semelhante ao utilizado por bacteriófagos para injectar o DNA em células-alvo 17. Na cultura líquido, a estrutura tubular do T6SS podem quebrar com mais facilidade, inter-bacteriana contato pode ser perdida, e as toxinas não são eficientemente entregue.
Em termos de tempos de incubação, as 5 primeiras horas de contacto que descrevem entre a estirpe doadora e a presa são suficientes para observar a morte bacteriana entre P. aeruginosa e E. coli, tal como ilustrado na Figura 3 </strong>. No entanto, é aconselhável ajustar o tempo de incubação através da realização de uma cinética de modo a optimizar as condições experimentais.
Uma vez que este método é uma técnica baseada em cor, os resultados de saída pode ser comprometida pela pigmentação da estirpe doadora. Por exemplo, no caso do P. aeruginosa, algumas linhagens produzem níveis elevados de pigmentos de cor, tais como piocianina e pyoverdine, o que pode interferir com a leitura de ensaio, fazendo com que a distinção da presa relativamente difícil. Outros cromogénicos β-galactosidase substratos, tais como o magenta gal-gal ou o vermelho-, podem ser usados em vez de X-gal (Tabela 1).
O ensaio de competição pode fazer uso de outros genes repórter para a leitura. Por exemplo, o ensaio semelhante foi também realizada usando a proteína verde fluorescente marcado com presas 12.
O nosso ensaio, ao passo que não quantitativas, dá uma boa indicaçãoda actividade T6SS uma vez que é baseada na sobrevivência ou a morte de uma presa repórter. Esta técnica apresenta a vantagem de ser fácil e conveniente para avaliar a actividade bactericida / bacteriostase de T6SSs de quaisquer espécies de bactérias. Até agora, a actividade do T6SS foi demonstrado contra bactérias Gram-negativas e nenhum exemplo claro de T6SS sensíveis bactérias Gram-positivas foi relatado ainda 12. É também óbvio que a incompatibilidade na cultura das diferentes espécies bacterianas para testar (por exemplo, temperatura de crescimento, oxigenação, meios específicos), deve ser considerado.
O nosso ensaio pode também ser utilizado para avaliar quais dos componentes T6SS são absolutamente essenciais uma vez que mesmo vestígios de uma toxina secretada pode ser suficiente para matar a presa. Mesmo fraca actividade dos T6SS poderia então ser claramente detectado pelo nosso ensaio, em comparação com o padrão de secreção procedimento de teste dependente da T6SS blot utilizando sobrenadante de cultura e ocidentalanálise. No entanto, uma adequada colónia formadora de unidade de contagem (UFC) é ainda necessário para a quantificação exacta desta actividade T6SS.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust concessão WT091939MA. Alain Filloux é apoiado pela Royal Society.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| P. aeruginosa PAKΔretS (D+) (active T6SS) |
Lab strain | Described in Reference 16 | |
| P. aeruginosa PAKΔretSΔH1-T6SS (D–)(inactive T6SS) | This study | The H1-T6SS cluster (encompassing the genes PA0070 to PA0095) has been deleted by allelic exchange following the procedure described in Reference 18. The mutator fragment was generated with the following set of primers: The Up fragment primers: 5′-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3′, and 5’CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3′. The Down fragment primers : 5′-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3′, 5'-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3' |
|
| E.coli DH5α | Invitrogen | 18258-012 | F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 |
| pBluescript II SK(+) | Agilent | 212205 | This vector expresses the α peptide of β-galactosidase used for α-complementation. |
| X-gal | Invitrogen | 15520-018 | Use at 40 μg/ml |
| Luria Bertani agar | Merck-chemicals | 1.10283.0500 | |
| TSB (casein soya bean broth) | Oxoid | CM109 | |
| Vortex shaker Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| Scanner | Epson | V700 | |
| Spectrophotometer | WPA Biowave | CO8000 Cell Density Meter | |
| Magenta-gal | Bioworld | 30350001-1 (715241) | |
| Red-gal | Research organics | 1364c | |
Table 1. Strain, plasmid, material and reagent used. |
Riferimenti
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