的视觉检测，以监测T6SS介导的细菌竞争

1。细菌菌株和文化工程师变换（使用标准的氯化钙处理或电）15 E.大肠杆菌受体细胞（猎物，P）与允许的 lacZ基因（ 表1）中的a-互补的质粒的大肠杆菌 DH5α细胞。板的Luria-Bertani琼脂平板上的转化细胞（LBA，1.5％琼脂），含有5 – 溴-4 – 氯 – 吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal的），在40毫克/毫升的最终浓度和合适的抗生素。孵育在37°C过夜，第二天早上选择蓝色的转化（见第1.3节）。 成长的铜绿假单胞菌 ，T6SS活性的供体细胞（D +）或T6SS的惰性（D-），（表1）上的LBA过夜，在37℃下在给出的例子在这里我们使用的是P.铜绿假单胞菌可再生能源技术的应变拥有一个组成活性H1-T6SS 16和一个等位基因突变的的H1-T6SS的基因簇（ 表1）的删除。 第二天，准备通宵充气烧瓶液体培养接种明亮的蓝色克隆之间的E. §1.1中描述的大肠杆菌转化体（P），从板，在5毫升的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）辅以适当的抗生素。在搅拌下成长，在37°C。 §1.2中描述的从板的单菌落（D +）和（D – ），继续进行同样。 2。竞争法 LBA板准备第二天的实验。确保这些板块干燥（附近的本生灯，或在层流柜）。准备一个“检测输入”板（A输入）的菌株（D +），（D – ），和（P </strong>）。准备“法输出”（A-输出）的菌株板（D – + P）和（D + + P）。划分和标记板。 过夜后生长（见第1.3节），测量输入细菌培养（D – ，D +和P）的光密度（OD 600nm的），并计算所需要的体积，得到细胞密度相当于1个单位的每个菌株OD 600nm为。每个“输入”细胞培养物（D – ，D +和P）的最初收集在一个无菌1.5毫升Eppendorf管中。 以13,000 rpm离心细菌样品在室温下的1分钟期间，并弃去上清液。 重悬的粒料的 D – ，（D）+，和 P的文化，在100μl新鲜TSB通过轻轻移液接种10毫升的各对应作为一个单一的点上的“A-输入”板（§2.1）中制备的相应的应变。 接种“A-输出板（§2.1编制）。更精确地，轻轻混匀，30微升（D +）与30微升（P）和30微升的（D – ）用30毫升（P）的两个单独的Eppendorf管中（注意，所使用的培养是在§2.4中描述的那些） 。接种20μl的混合物（D）+（/ P）和（D – / P），“输出”的板作为单独的点上。允许斑点附近的一个本生灯干燥并放置一段适当的时间，在此期间，杀死细菌正在发生的板在37℃的培养箱中。在的情况下的 P 铜绿假单胞菌 ，有效的杀死细菌培养5小时后观察比较T6SS积极与T6SS缺陷株。 3。定性观察的t他杀死细菌准备的LBA板含有40微克/毫升X-gal的用于读出的测定。板将被称为“读数输入”或“R-输入”发现分离出的细菌或“读出输出”或“R-输出”发现混合细菌培养，这样读出的查杀性能。这些板块也需要得到适当的干燥。除以板在它的后面的四个相等的部分，这些部件和注释0，10 -1，10 -2，10 -3，指定的细菌培养物的稀释液的琼脂平板上发现（见第3.3节）。的稀释将允许在同一个地方的蓝/白菌比半定量评价。 收集的无菌环的单个细菌斑点从“A-输入板（见§2.4）和”输出“板（见§2.5），重悬在不同的1.5 mL的Eppendorf管中含有1毫升TSB每个点。将在30分钟到离心振动筛块重悬有效地细菌。 准备了一系列的5倍的3个Eppendorf管含900微升TSB的，每个重悬点至10倍系列稀释到10 -3继续进行。请一定要更换吸头和涡5秒之间每个稀释步骤。 继续LBA板干燥最摊薄未稀释的悬浮液中含40μg/ ml的X-gal的准备§3.3细菌稀释，使得这些“R-输入”车牌为“A检举输入点“的”R-输出“为”A-输出点“（ 图2）的板。涡简要每个管中，然后再进行检举保持均匀的菌悬液。的可重复性的结果，在一个象限中的点20μl，以一式三份（ 图2）。你的盘子的相对干燥，在这​​个阶段是很重要的，因为点需要保持单独分离板，而不是向对方滑行。的竞争测定甲量化也可以在此阶段的实验。之后的步骤3.3中，100微升稀释10 -3 LBA板含有40微克/毫升X-gal的传播。对于重复性的结果，从“A-输出”板电镀一式三份的每一个点。将稀释板中，在37℃培养箱中培养过夜（相应于孵育16小时）。继续的蓝色菌落计数（P细胞仍然活着）。典型的竞争5小时后，得到的结果如图3所示。 发布的无菌区域内板开（无盖），以允许过量的液体的吸收，各点内。 板放置在37℃培养箱中过夜。在此温育时间，杀害仍然发生在混合（D + / P）的时间这两个菌株仍处于接触。 拍摄一张照片或扫描您的输出分析的板（ 图2）。点仍然在很大程度上蓝色表明，E.菌没有被杀死的P.铜绿假单胞菌 。这是E.大肠杆菌混合与T6SS缺陷P.铜绿假单胞菌菌株（D-）（图2中 ，板在右下角）。