Экс естественных Живая съемка Одноместный клеточных делений в мышь нейроэпителия
Summary
Здесь мы разрабатываем инструменты, необходимые для<em> Экс естественных условиях</em> Живого изображения проследить одну клеточных делений у мышей E8.5 нейроэпителия
Abstract
Мы разработали систему, которая интегрирует живых изображений флуоресцентных маркеров и культивирования эмбриональных ломтиками нейроэпителия мыши. Мы воспользовались существующими линиями мышей клетки для генетической отслеживания клонов: тамоксифен индуцируемых Cre и линии репортер экспрессирующих Cre DsRed на Cre-опосредованной рекомбинации. Используя относительно низкий уровень тамоксифен, мы были способны индуцировать рекомбинации в небольшое число клеток, что позволяет нам следовать отдельных клеточных делений. Кроме того, мы наблюдали транскрипционный ответ на Еж Соник (Тсс) сигнализации использованием Olig2-EGFP трансгенной линии 1-3 и мы провели мониторинг формирования ресничек путем заражения культурный срез с вирусом выражающие реснички маркером, Sstr3-GFP 4. Для того, чтобы изображение нейроэпителии, мы собрали эмбрионов на E8.5, изолированный нервной трубки, смонтированные нейронных ломтик в надлежащих условиях культивирования в изображения камеры и выполнена покадровой конфокальной микроскопии. Наши бывшиеестественных изображений живых метод позволяет проследить одну клеточных делений оценить относительные сроки формирования первичной реснички и Тсс ответ в физиологически соответствующие образом. Этот способ может быть легко адаптирован использованием различных флуоресцентных маркеров и обеспечивает поле инструментами для контроля поведения клеток на месте и в режиме реального времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наши бывшие естественных условиях система дает нам возможность непосредственно наблюдать одну клеточных делений в развивающемся нейроэпителия в реальном времени. В качестве примера мы рассмотрели клеточные деления в мышиных эмбриональных нервной трубки и контролируется либо ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот исследовательский проект был поддержан Дополнение ARRA, 5 R01 NS056380. Дополнительная поддержка была оказана в рамках основной вирусный вектор и микроскопии Ядро Эмори Neuroscience NINDS Основные средства гранта, P30NS055077. Мы благодарим Эмори трансгенных мышей и генного таргетинга для получения основной линии мышей от GENSAT; Грег Pazour для стабильного SSTR3-GFP IMCD3 клеточной линии, и Брэдли Yoder для Sstr3-GFP лентивирусный построить. Моноклональные антитела были получены из исследований развития гибридом банка, разработанный под эгидой NICHD, и поддерживается Университет Айовы, Отделение биологических наук, Iowa City, IA 52242. Все животные процедуры были одобрены IACUC и комитета по биобезопасности в университете Эмори.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Newborn calf serum | Lonza | 14-416F | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Rat Serum SD male | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| 1M Hepes | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutamine | GIBCO | 21041-025 | |
| Light mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Sstr3-GFP lentivirus | Emory Viral Core | ||
| Micro-knife, size 0.025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| 35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% petroleum jelly | Kroger | FL9958c | |
| A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| Imaris 3D software | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Parafolmaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffer | Lab made | ||
| Rat monoclonal anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Rabbit anti-Arl13b serum | NeuroMab | ||
| mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Rabbit anti-Olig2 | Chemicon | AB9610 | |
| Mouse monoclonals Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Mouse monoclonalsShh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Mouse monoclonals Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Rabbit polyclonal Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Hoechst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36934 |
Riferimenti
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
- Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
- Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
- Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
- Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), (2012).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).
