마우스 작은 섬 격리에 대한 자세한 설명은 collagenase와 중성 단백 분해 효소를 정제의 조합의 현장 췌장 ductal cannulation 및 재관류에의 기술을 사용하여 설명되어 있습니다.
베타 세포 유전자 발현과 체외에서 함수의 심문은 정면 쥐 tumorigenic 세포 라인의 연구에서 격리 된 쥐 섬의 연구에 년 동안 이동했다. 차 섬은 더 충실하게 세포 신호 경로와 분비 응답의 생물학을 반영하는 독특한 장점을 제공합니다. 조직 dissociating 효소 (TDE) 준비를 사용하여 작은 섬 고립의 방법이 잘 많은 실험실 1-4 년에 설립 된 반면, 특정 쥐 변형의 작은 섬 수율과 품질의 일관성의 변화는 범위와 주요 췌장 연구의 가능성을 제한 할 수 있습니다. 이러한 변화는 종종 작은 섬 격리 절차에 사용되는 원유 부분적으로 정화 TDEs의 결과로 발생, 자주 활동에 많은 – 투 – 많은 유사 전시하고 자주 사용되는 효소의 복용에 조정을 필요로 TDEs. 보고서의 소수의 쥐 세포 isolations에 대한 TDEs 5, 6을 정화 사용한 </suP는>하지만, 연습은 인간의 작은 섬에 isolations에 대한 TDEs을 정화의 일상 사용과 장점에도 불구하고 광범위한 없습니다. VitaCyte, LLC (인디애나 폴리스, IN)와 협력하여, 우리는을 통해 원유 조직 분류 다음 TDEs은 생쥐의 췌장 덕트에 직접 perfused되는 Gotoh 7, 8,에 의해 설명이에 따라 수정 마우스 작은 섬 절연 프로토콜을 개발 Histopaque 그라디언트 9, 섬을 정화의 고립. 우리 프로토콜의 중요한 차이는 정화 collagenase (CI 효소 MA)과 중성 단백 분해 효소 (CI 효소 BP) 조합의 사용이다. collagenase는 기판 6과 같은 휘황이라는 수용성 종아리 피부 원 섬유를 활용 6 형광의 콜라겐 굴욕 활동 (CDA) 분석의 사용에 의해 특징되었습니다. 이 기판으로 고유의 콜라겐에 의존하기 때문에 기판은 조직 매트릭스 콜라겐 저하의 동력학을 더 예측입니다. 단백 분해 효소는 채널이었습니다민감한 형광 운동 검정 10을 aracterized. 더 전통적인 생화학 분석과 함께 이러한 향상된 assays을 활용하면 TDE이 많은 사이의 향상된 성능의 일관성로 이어지는 더 일관되게 제조 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 C57BL / 6 마우스를 사용하여 최대 작은 섬 수율과 최적의 작은 섬의 형태에 최적화되었습니다. 이 프로토콜의 개발 기간 동안, collagenase하고 중립적 인 프로테아제의 여러 조합은 서로 다른 농도로 평가하고, collagenase의 최종 비율되었습니다 35:10의 중립 프로테아제는 시그마 타입 XI 비교 효소 성능을 나타냅니다. 쥐와 생쥐의 다른 변종의 평균 작은 섬 수율에 큰 변화가보고 되었기 때문에, TDE 구성의 추가 수정은 다른 종과 변종에서 발견 섬의 수율과 품질을 향상시키기 위해하여야한다.
이 프로토콜에서는, 우리는 Langerhans의 섬을 분리의 목적으로, cannulation, collagenase 재관류 및 손쥐 췌장의 분리에 대한 절차를 설명하고 있습니다. 기술적으로, 우리의 방법은 한번 습득, 동물을 euthanizing의 4 분 이내에 췌장 절연을 허용하고, 1 시간에 하나의 동물에서 섬의 고립을 초래할 것입니다. 기술의 급속은 우리가 따라서 최대 3000 섬까지 격리의 결과로, 최대의 전형적인 스트레치 12 마우스로 섬을 분리 할 수 있습니다.
collagenase의 원유 준비를 사용하는 다른 프로토콜과는 달리, 우리의 프로토콜은 정화 프로테아제, CI 효소 Collagenase MA 및 CI 효소 BP 프로테아제의 사용을 제공합니다. 상업적으로 사용할 수있는 TDE 준비의 일관성의 변화는 각이 많이 개별적으로 일반적인 사용하기 전에 테스트 및 최적화 할 것을 요구합니다. 이 많은 – 투 – 많은 다양성은 우리가 푸리의 사용을 고려했다VitaCyte에서 fied TDEs. 이러한 고도의 정화 TDEs은 민감한 형광 표시 기판 assays의 사용 등 다양한 방법으로 특징을 가지고 있습니다. 형광 CDA 분석이 저하 원래 콜라겐에서 다른 동력학을 collagenase의 다른 분자 형태에 더 민감하다. 역사 펩타이드 기판 assays는 collagenase의 불완전 평가를 제공합니다. 여러 방법으로 collagenase를 특성화하는 것은 많은 사이의 큰 효소의 활동을 보장합니다.
상업적으로 이용 가능한 collagenase를 준비 다양한를 사용하여 자체 테스트를 바탕으로, 우리는 정화 효소 조합 재현 많은 – 투 – 많은 결과를 굴복 것으로 나타났습니다. 이 응용 프로그램에서 높은 정화되고 엄격 특징 TDEs을 사용하여의 주요 장점은 한 번에 최적의 효소 성분이 정의되어 있으며, 많은 – 투 – 많은 성능의 일관성이 보장됩니다. 이 일관성은 일반적으로 필요한 많은 자격의 노동 집약적 프로세스를 제거원유 또는 농축 collagenase 제품에 대한. 정화의 TDEs는 다른 마우스 변종에서 발견 섬의 수율과 품질을 향상시키기 위해 구성의 추가 수정 할 수 있습니다. 마우스의 여러 변종에서 섬의 고립에 대한 최적의 효소 작품을보고는 더 효과적으로 전달 될 수 있습니다. 이것은 결과적으로, 자원 및 실험 디자인 개선 유연성을보다 생산적 사용로 연결됩니다.
우리의 프로토콜을 사용하여 작은 섬 isolations의 결과에 영향을 미칠 수있는 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 효소 준비 재관류 동안 췌장의 효율적인 인플레이션을 달성 할 필요가 있습니다. 이 주사기에 부드러운 힘으로 인플레이션을 시작하고, 췌장의 웃기로 힘을 증가하는 것이 중요합니다. 그것은 창자를 이동하고 collagenase이 전체 오르간을 perfuses 있도록 인플레이션 동안 췌장을 올려 도움이 될 것입니다. 또 다른 중요한 단계는 하나가 튜브 afte을 흔드는되는 힘이다37 ° C (단계 2.2)에서의 R 배양. 우리는 튜브의 캡에 대한 하드 췌장을 흔들어 것은 섬의 분열을 초래하지만이 단계에서 기계적 분리 어떠한 형태없이 작은 섬 수율이 크게 떨어질 수 있다는 것을 발견했습니다. 그것은 주사기 (단계 2.5)로 분리 단계에서, 중간 수준의 힘이 플런저와 위, 아래로 이동하는 동안 적용되는 것 또한 중요합니다,이 필터링 단계 (2.6) 이전에 적절한 조직 분리를 보장 어디로 거의 조직은 차 스트레이너 필터에 보관해야합니다. 마지막으로,주의 깊게 따라야 할 마지막 단계는 histopaque fractionated 섬의 전체 20 ML의 포부입니다. 섬은 histopaque하고 HBSS의 인터페이스에서 일반적이지만, 우리는 인터페이스를 제거하려고 할 때 우리가 섬을 잃고 발견 대신, 우리는 이제 큰 구멍 25 ML의 pipet을 사용하여 전체 20 ML를 제거합니다. 우리는 c에의 필요성을 제거하는 역 70 μm 필터 (단계 2.11)를 통해 여과를 추가histopaque을 멀리 씻어 반복 섬을 entrifuge.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH 보조금 R01 DK060581, R01 DK083583 (RGM에 모두)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
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Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |