تضخيم بروتين دوري Misfolding من البريونات
Summary
التضخيم البروتين دوري misfolding (PMCA) هو فحص المختبر في لدراسة تحويل بريون والحواجز سلالة والأنواع. ويمكن أيضا أن تستخدم لفحص الكشف عن بريون.
Abstract
البريونات هي العوامل المعدية التي تسبب الوفاة حتما انتقال مرض جنون (TSE) في الحيوانات والبشر 9،18. من بروتين بريون اثنين من الأشكال الإسوية متميزة، وغير المعدية المضيف ترميز البروتين (بي ار بي C) والبروتين المعدية (بي ار بي SC)، وهو شكل الإسوي بشكل غير طبيعي مطوية من C بي ار بي 8.
واحدة من التحديات التي تواجه العمل مع وكلاء بريون هي فترة حضانة طويلة قبل وضع العلامات السريرية بعد التلقيح المضيف 13. هذا تكليف تقليديا طويلة ومكلفة الدراسات الأحيائي الحيواني. وعلاوة على ذلك، تتميز سيئة خصائص البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية للبرأسية بي ار بي بسبب التشكل غير عادية والدول التجميع.
بي ار بي برأسية البذور يمكن تحويل C بي ار بي بي ار بي إلى اتفاقية استكهولم في المختبر 14. PMCA هو أسلوب المختبر في أن يأخذ أدفاntage من هذه القدرة باستخدام صوتنة والحضانة دورات لإنتاج كميات كبيرة من بي ار بي برأسية، بمعدل متسارع، من نظام التي تحتوي على كميات الزائدة من بي ار بي C وكميات ضئيلة من البذور برأسية بي ار بي 19. وقد ثبت أن ألخص هذه التقنية بشكل فعال خصوصية الأنواع وسلالة من بي ار بي برأسية التحويل من C بي ار بي، لمحاكاة التدخل سلالة بريون، وتضخيم مستويات منخفضة جدا من بي ار بي برأسية من الأنسجة المصابة، والسوائل، والعينات البيئية 6،7،16، 23.
هذه الورقة تفاصيل البروتوكول PMCA، بما في ذلك توصيات للتقليل من التلوث، وتوليد نتائج متسقة، وقياس تلك النتائج. نناقش أيضا العديد من التطبيقات PMCA، بما في ذلك الجيل وتوصيف سلالات بريون المعدية، بريون تدخل السلالة، وكشف عن البريونات في البيئة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحديات تضخيم بروتينات بريون المعدية هي فترات حضانة طويلة ونفقات في التجارب المجراة. هذه التقنية هي وسيلة PMCA فعالة من حيث التكلفة لتضخيم وكلاء بريون المعدية. وقد أكدت عدة مختبرات قدرة PMCA بدقة لتضخيم سلالات بريون في المختبر 7، 9، 12، 14، 19،24.
<p class="jov…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور نجمة المساء الحديد ماري راموس لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد (P20 RR0115635-6، C06-01 RR17417 وG20RR024001) والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (2R01 NS052609).
Materials
| Reagent / Equipment | Manufacturer | Cat. Number |
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 |
| Tenbroeck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 |
| Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-00 |
| DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV |
| Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 |
| Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
Riferimenti
- Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease. PLoS pathogens. 7, e1001317 (2011).
- Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype. PLoS Pathog. 5, e1000421 (2009).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).
- Bessen, R. A., Marsh, R. F. Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).
- Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, 757-768 (2008).
- Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. Cell-free propagation of prion strains. EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).
- Caughey, B., Raymond, G. J. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).
- Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).
- Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. Competition between different scrapie agents in mice. Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).
- Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. Detection of infectious prions in urine. FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).
- Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers. PLoS Pathog. 4, e1000139 (2008).
- Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously. J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).
- Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature. 370, 471-474 (1994).
- Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N. Virology. 387, 3235-3240 (2009).
- Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. Environmental sources of scrapie prions. J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).
- Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area. Prion. 3, 171-183 (2009).
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, 136-144 (1982).
- Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411, 810-813 (2001).
- Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).
- Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type. Journal of virology. , (2011).
- Schutt, C. R., Bartz, J. C. Prion interference with multiple prion isolates. Prion. 2, 61-63 (2008).
- Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource. Journal of. 84, 5706-5714 (2010).
- Shikiya, R. A., Bartz, J. C. In vitro generation of high titer prions. Journal of virology. , (2011).
- Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA. Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).
