Summary

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Published: August 08, 2012
doi:

Summary

Questo articolo descrive prima di una procedura per isolare cellule endoteliali umane da vena ombelicale e poi mostra come utilizzare queste cellule per esaminare la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso. Utilizzando un basso volume camera di flusso realizzati da un polimero con le caratteristiche ottiche di vetro, live-cellula imaging a fluorescenza di popolazioni di cellule rare è anche possibile.

Abstract

I neutrofili sono il tipo più abbondante di globuli bianchi. Essi costituiscono una parte essenziale del sistema immune innato 1. Durante l'infiammazione acuta, i neutrofili sono le prime cellule infiammatorie a migrare verso il luogo della ferita. Assunzione di neutrofili a un sito della lesione è un processo graduale che comprende in primo luogo, la dilatazione dei vasi sanguigni per aumentare il flusso di sangue, in secondo luogo, microvascolari cambiamenti strutturali e la fuga di proteine ​​del plasma dal sangue, in terzo luogo, rolling, adesione e la trasmigrazione dei neutrofili attraverso l' accumulo di neutrofili e quarto al sito della lesione 2,3; endotelio. Una vasta gamma di in vivo e in vitro è evoluto per consentire lo studio di questi processi 4. Questo metodo si concentra sulla trasmigrazione neutrofili attraverso cellule endoteliali umane.

Un metodo popolare per esaminare i processi molecolari coinvolti nella trasmigrazione dei neutrofili utilizza umana neutrophils interagiscono con le cellule primarie umane vena ombelicale endoteliali (HUVEC) 5. L'isolamento dei neutrofili è stato descritto visivamente altrove 6; così questo articolo mostrerà il metodo per l'isolamento di HUVEC. Una volta isolate e coltivate a confluenza, le cellule endoteliali vengono attivate causando la sovraregolazione di molecole di adesione e di attivazione. Ad esempio, l'attivazione di cellule endoteliali con citochine come TNF-a risultati aumentati E-selectina e IL-8 espressione 7. E-selectina media di cattura e di rotolamento dei neutrofili e IL-8 di attivazione media e ferma adesione dei neutrofili. Dopo l'adesione dei neutrofili trasmigrare. Trasmigrazione può avvenire paracellularly (mediante giunzioni di cellule endoteliali) o transcellularly (attraverso la cellula endoteliale stesso). Nella maggior parte dei casi, queste interazioni avvengono in condizioni di flusso presenti nel sistema vascolare 7,8.

Il parallelo camera di flusso piatto è un sistema largamente utilizzato, che mimicrofoni il taglio idrodinamico sollecitazioni trovato in vivo e permette lo studio del reclutamento dei neutrofili in condizioni di flusso in vitro 9,10. Diverse aziende producono parallele camere di flusso di targa e hanno ciascuno vantaggi e svantaggi. Se fluorescente immagini è necessario, vetro o un polimero otticamente simile deve essere utilizzato. Le cellule endoteliali non crescono bene su vetro.

Presentiamo qui un metodo semplice e rapido per l'imaging a contrasto di fase, DIC e fluorescente di trasmigrazione neutrofili con un basso volume di diapositiva canale ibidi fatto di un polimero che supporta l'adesione e rapida crescita di cellule endoteliali e ha qualità ottiche comparabili a vetro. In questo metodo, le cellule endoteliali sono state coltivate e stimolata in μslide ibidi. I neutrofili sono stati introdotti in condizioni di flusso e la trasmigrazione è stata valutata. Imaging a fluorescenza delle giunzioni attivato in tempo reale la determinazione del grado di paracellulare rispettotrasmigrazione transcellulare.

Protocol

1. Isolamento e manutenzione di cellule endoteliali vascolari umane Procedure di biosicurezza di livello 2 deve essere utilizzato quando si lavora con sangue umano e dei tessuti. Utilizzando forbici tagliare il cordone dalla placenta e poi esaminate con attenzione il cavo di coaguli di sangue ei danni causati dalla chiusura il cavo durante il parto. Tagliare ed eliminare queste porzioni del midollo. Preparare la soluzione fresca collagenasi a 1 mg / ml versando 50 ml di tampone cavo caldo in un tubo…

Discussion

I ricercatori hanno utilizzato di routine cellule endoteliali da diversi letti vascolari per studiare il reclutamento dei neutrofili e trasmigrazione. Esempi includono, ma non sono limitati a, derma cellule endoteliali microvascolari 12, fegato cellule endoteliali sinusoidali 13 e cellule endoteliali di vena ombelicale umano 10. Tra questi HUVEC acquisito vasta popolarità a causa della loro relativa facilità di isolamento e di disponibilità. HUVEC sono un potente modello in …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dott. Pina Colarusso e Live strumento imaging cellulare per la loro assistenza, con immagini e analisi di immagine, la signora Lailey per la sua assistenza tecnica, e 51 unità presso l'Ospedale Foothills in Calgary, AB per la fornitura di cordoni ombelicali umani. Dr. KD Patel è un Innovates Alberta: Salute Scientist Solutions. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di funzionamento degli Istituti canadesi di ricerca Salute e contributi per investimenti fissi e delle infrastrutture da parte della Fondazione canadese per l'innovazione e la scienza Alberta e Autorità di ricerca.

Materials

Reagent and Equipment Company Catalogue number Comments
Collagenase Type 1 Worthington 4197  
Cord buffer     Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4
Endothelial Cell Media (ECM)     M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml
M199 GIBCO 31100-035  
Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) Invitrogen 10378-016  
Ibidi chambers Ibidi 80606  
TNF-α Prepro Tech 300-01A  
Human Albumin 20% solution Gemini Bioproducts 800120050  
HBSS without Ca2+ and Mg2+ Sigma H2487-10X  
HBSS with Ca2+ and Mg2+ Sigma H1387-10X  

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).

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