I tentativi di esprimere la fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) in<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Hanno, finora, ha prodotto quantità relativamente basse di proteina. Questo protocollo e dei reagenti associati distribuiti attraverso la Cystic Fibrosis Foundation dovrebbe consentire la preparazione di quantità dell'ordine di milligrammi di questa proteina 'difficile' della membrana eucariotica.
Il regolatore transmembrana della fibrosi cistica conduttanza (CFTR) è un canale cloruro, che quando mutati, può dar luogo alla fibrosi cistica in humans.There è pertanto notevole interesse in questa proteina, ma sforzi per studiare la struttura e attività sono stati ostacolati dalla difficoltà di esprimere e purificare quantità sufficienti di proteina 1-3. Come molti 'difficili' proteine di membrana eucariotica, espressione in un organismo in rapida crescita è auspicabile, ma impegnativo, e nel lievito S. cerevisiae, finora basse quantità sono stati ottenuti e rapida degradazione della proteina ricombinante è stata osservata 4-9. Le proteine coinvolti nel trattamento di CFTR ricombinante in lievito sono stati descritti 6-9. In questa relazione si descrive un metodo per l'espressione di CFTR in lievito e la sua purificazione in quantità significativa. Il protocollo descrive come i problemi proteolisi precedenti possono essere superati e come livelli di espressione diCFTR può essere notevolmente migliorata modificando le condizioni di crescita cellulare e controllando le condizioni di induzione, in particolare il periodo di tempo prima della raccolta delle cellule. Le reagants associati a questo protocollo (CFTR murino che esprimono le cellule di lievito o plasmidi di lievito) saranno distribuiti attraverso la Cystic Fibrosis Foundation statunitense, che ha sponsorizzato la ricerca. Un articolo che descrive la progettazione e la sintesi del CFTR costrutto impiegato in questa relazione sarà pubblicata separatamente (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, inedito). In questo articolo vi spiegheremo il nostro inizio metodo con la trasformazione delle cellule di lievito con il CFTR costruire – lievito contenente plasmide (Fig. 1). Il costrutto ha una proteina verde fluorescente (GFP) fusa alla sequenza CFTR al suo C-terminale e segue il sistema sviluppato da Drew et al. (2008) 10. La GFP permette l'espressione e la purificazione di CFTR da seguire con relativa facilità. Il protoc JOVE visualizzatofiniture olo dopo la preparazione di microsomi delle cellule di lievito, anche se si comprendono alcuni suggerimenti per la purificazione della proteina dai microsomi. I lettori possono aggiungere proprie modifiche alla procedura di purificazione microsoma, a seconda degli esperimenti finali da effettuare con la proteina e le attrezzature locali a loro disposizione. Il lievito-espresso proteina CFTR può essere parzialmente purificato di ioni metallici con cromatografia di affinità, utilizzando un tag intrinseca purificazione poliistidina. Dopo cromatografia ad esclusione dimensionale produce una proteina che sembra essere> 90% puro, come giudicato da SDS-PAGE e colorazione Coomassie-del gel.
Questo documento fornisce un metodo per l'espressione di CFTR proteina murina in cellule di lievito, che dovrebbe facilitare la ricerca sulla fibrosi cistica. L'obiettivo è di collegare questo articolo con il rilascio del DNA murino CFTR costrutto, che sarà disponibile attraverso la Cystic Fibrosis Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Altro ortologhi dovrebbero essere resi disponibili in seguito. La trasformazione delle cellule di lievito con il vettore contenente CFTR è semplice, ma è importante schermo per colonie che esprimono livelli elevati di CFTR. I livelli di espressione variabili possono derivare da diversi fattori, ma il numero di copie del plasmide per cella rappresenta probabilmente un significativo grado di variazione. Passaggi critici descritti qui dovrebbero consentire la produzione di CFTR che esprimono cellule di lievito e CFTR contenenti le membrane microsomiali. Dopo la trasformazione, la crescita, la raccolta e la lisi delle cellule di lievito sono stati masterizzati, purificazione della proteina dovrebbe essere possibile, e in Figura 3 abbiamo dato un esempio di purezza che dovrebbe essere realizzabile in questo caso come punto di riferimento utile. Non è nostra intenzione in questo manoscritto di fornire metodologia dettagliata per la purificazione della proteina. Tuttavia, ci sono alcuni punti critici di purificazione a valle che sono specifici per il sistema di espressione S.cerevisae, come lisi cellulare e purificazione microsoma, e questi sono stati inclusi in dettaglio in questo manoscritto. Va ricordato, tuttavia, che oltre ai due metodi che abbiamo usato, metodi alternativi di rottura delle cellule di lievito può essere impiegata, come l'uso di una cella di pressione francese. La proteina ricombinante ha un TEV distaccabile dominio C-terminale GFP che consente alla proteina di essere rintracciato dopo induzione (Fig. 4). Lievito hanno una proteina intrinseca 70kDa (probabilmente succinato deidrogenasi 12) che reagisce alle medesime condizioni 11, e questo può fornire un altro utilestandard di calibrazione nale per i livelli di espressione relativi di CFTR in estratti di cellule intere o microsomi (Fig. 3). È evidente dai dati riportati nella Figura 4 che i tempi di raccolta di cellule dopo induzione con galattosio è cruciale. Le rese di goccia CFTR precipitosamente dopo circa 16 ore di induzione, in modo che non vi è quasi alcun CFTR rilevabile in cellule di lievito dopo 24 ore di induzione.
La resa di proteina purificata è di circa 1-2mg proteina CFTR cultura fermentatore per 15 litri. Il recupero può essere stimato come circa il 70% del totale CFTR-GFP proteina fino allo stadio microsoma, e circa il 25% di recupero di proteina purificata. Caratterizzazione del S. cerevisiae-espresso CFTR è in corso. Come si vede in fig. 4, posizione della proteina nella cellula può essere monitorato mediante microscopia a fluorescenza. Sebbene il fluorescenza si trova attorno alla periferia della cella come previsto 10, alcune delle proteine mostra una localizzazione puntata, sia in, oappena dentro la membrana plasmatica, che potrebbe essere dovuto ad CFTR riciclaggio con un ritardo Golgi / endosomal percorso 14 o forse a valle del nascente comparto delle vescicole di trasporto dal pronto soccorso 4. Il trattamento con PNGaseF, un enzima che deglycosylates proteine, ha mostrato variazioni minime della migrazione della banda di proteina CFTR su SDS-PAGE, implicando che è non glicosilata, o ha glicosilazione minima 15. Esperimenti sullo stato di fosforilazione della proteina sono in corso. In alcuni dei detergenti testati finora, la proteina purificata visualizza ATPasi (che è inibita da un inibitore specifico CFTR-16) a velocità che sono simili a quelle tradotto 2,15. Misurazione dell'attività canale CFTR richiederà ricostituzione della proteina purificata, che comporterebbe una fase finale di purificazione in un detergente che ha una relativamente alta concentrazione micellare critica (CMC) 17. Lievito microsomi containing CFTR possono essere solublised con vari detergenti comunemente impiegati, tra cui 18 detergenti come dodecil maltoside 2, che sono generalmente considerati 'mild'. Tuttavia detergenti cmc più elevati hanno dimostrato di essere inefficiente per solubilsation, finora, suggerendo che lo scambio in questi detergenti devono essere considerati in una fase successiva in qualsiasi schema di purificazione.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Cystic Fibrosis Foundation (CFF) per il finanziamento di questo lavoro attraverso il suo Consorzio CFTR struttura 3D (codice di autorizzazione FORD08XX0). Noi riconosciamo l'enorme contributo di tutti i colleghi all'interno del Consorzio a questo lavoro, in particolare nella progettazione dei geni CFTR. Abbiamo anche riconoscere i contributi preziosi di Drs. James Birtley (NCSR Democrito, Grecia), Mark Young (Università di Cardiff, UK) e David Drew (Imperial College, London, UK) nelle prime fasi del lavoro. Noi in particolare ringraziare il Dr. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) per la lettura critica del manoscritto.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |