التعبير وتنقية عبر الغشاء التليف الكيسي بروتين منظم المواصلة في خميرة الخباز

1. إعداد وسائل الإعلام والمخازن YNB: للحصول على لتر واحد، وتعليق 6،9 النيتروجين خميرة ز قاعدة بدون الأحماض الأمينية و 0.77 غرام مزيج تكملة كاملة دون اليوراسيل في الماء ل 1. الأوتوكلاف. تخزن في درجة مئوية 4 YNBA: للحصول على 400 مل، بتعليق 2.76 النيتروجين خميرة ز قاعدة بدون الأحماض الأمينية، 0،38 غرام مزيج تكملة كاملة دون اليوراسيل و8G أجار الجرثومية في مل من الماء 350. الأوتوكلاف. خلط 8 الجلوكوز غ مع 50 مل ماء والحرارة بلطف حتى حل. Sterilise من خلال مرشح ميكرون 0.2 و إضافة إلى YNBA بينما أجار غير منصهرة. تخزن في درجة حرارة الغرفة. 20٪ متوسط ​​نسبة الجلوكوز: للحصول على 500 مل، مزج 100 غرام جلوكوز مع YNB 500 مل والحرارة بلطف حتى حله. تمر من خلال مرشح ميكرومتر 0.2 في زجاجة دوران عقيم. تخزن في درجة حرارة الغرفة. خلط للحصول على 2 ليتر، 400 غ سكر اللبن مع YNB 2L والحرارة بلطف حتى حل: 20٪ متوسط ​​الجالاكتوز. تمر من خلال مرشح ميكرون 0.2 في زجاجة دوران عقيم. متجر في المزاج غرفةature. أسهم المانع البروتيني: CFTR هو عرضة للتحلل البروتين 4. وجد الباحثون أن مثبطات بعد أن تكون فعالة في الحد من التحلل البروتيني، على الرغم من القراء قد يرغب في صياغة هذه القائمة لتلبية الاحتياجات الخاصة بهم. متجر في 100 aliquots ميكرولتر في -20 درجة مئوية للحد من تجميد ذوبان المشاكل. وينبغي أن يخفف من جميع مثبطات الحلول الأسهم إلى تركيز العمل على النحو التالي: المانع الأسهم تركيز تحضير الأوراق المالية تركيز العمل AEBSF 200 ملي مول 48mg حل في الماء المقطر 1ml 0.2 ملم Benzamidine 300 ملم 36mg حل في الماء المقطر 1ml 0.3 مم Chymostatin 4 ملم حل 2.5mg في 1ml DM جافSO 4 ميكرومتر E-64 7 ملم 2.5mg حل في الماء المقطر 1ml 7 ميكرومتر Leupeptin 20 ملي مول 10mg حل في الماء المقطر 1ml 20 ميكرون Pepstatin A 15 ملم حل 10mg في DMSO 1ml جاف 15 ميكرومتر PMSF 1 م حل 174mg في DMSO 1ml جاف 1 مم DTT (1 م): 154 ملغ dithiothreitol ذوب في الماء المقطر 1ml. مخزن عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. وأشار استخدم في تخفيف 1:1000 في المخازن. EDTA (0.5 م): مزيج حمض ز 29.22 ethylenediaminetetraacetic مع ماء 100 مل. إضافة 10 N هيدروكسيد الصوديوم قطرة قطرة حتى كل من EDTA قد حلت، ودرجة الحموضة يصل إلى 8. جعل ما يصل الى 200 مل مع الماء وتمر من خلال 0.2 ميكرون مرشح في زجاجة دوران عقيم. تخزن في درجة حرارة الغرفة. CRB (300 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك،درجة الحموضة 7.4، 0.56 M السوربيتول، 1 ملم EDTA): ذوب 18،17 ز تريس القاعدة في مل من الماء 350 و ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 قبل إضافة حمض الهيدروكلوريك. إضافة 51،35 ز السوربيتول وجعل حجم ما يصل الى 500 مل مع الماء. الأوتوكلاف. إضافة 1 مل من محلول EDTA الأوراق المالية ومخزن في 4 درجات مئوية. CFTR العازلة (50 ملم تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 10٪ V / V الجلسرين): ذوب 6،06 ز تريس القاعدة في 500 مل من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 8 مع حمض الهيدروكلوريك، إضافة 100 مل من الجلسرين، وجعل ما يصل إلى 1 لتر بالماء. الأوتوكلاف ومخزن في درجة مئوية 4 2X صبغ الحمل: 50 مم تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.6)، الجلسرين بنسبة 5٪، 5 مم EDTA (درجة الحموضة 8.0)، 0.02٪ زرقة البروموفينول، SDS 4٪، 0.05 متر DTT. جعل 10 مل، قسامة وتخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. 2. فحص Transformants هذا البروتوكول يفترض أنه تم إدراج هذا الجين الانصهار CFTR-GFP-8His الى المصب خميرة البلازميد إلى مروج الجالاكتوز GAL1 (Fig.1) والتي تم تحويلها من البلازميد إلى FGY217 الخلايا، حذف Pep4 متحولة من S.cerevisiae 10 </em>. يمكن زراعة الخلايا على لوحات YNBA وتخزينها لعدة أسابيع في 4 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل، ينبغي بذل أسهم الجلسرين وتخزينها في -80 درجة مئوية. وصفت وسائل للاستنساخ والتحول بالتفصيل من قبل درو وآخرون (2008) 10. اختيار جيد 5-10 فصل المستعمرات من لوحة التحول. نقل كل مستعمرة إلى 50 أنبوب منفصل معقم الصقر مل تحتوي على 9 مل YNB و1ml من متوسط ​​نسبة الجلوكوز بنسبة 20٪. لهذه الخطوة، فمن المهم أن يكون هناك تركيز النهائي من الجلوكوز 2٪ (W / V) في الثقافة للحفاظ على نمو الخلايا. تنمو بين عشية وضحاها لمدة 16 ساعة في 250 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية في حاضنة المدارية اهتزاز. جعل أسهم الجلسرين لكل من المستعمرات فرزهم. إضافة جو معقم و مطهر 0.8 مل من الثقافات بين عشية وضحاها إلى الجلسرين 0.2 مل العقيمة في قارورة المسمار أعلى وصفت، لفترة وجيزة، ومخزن في دوامة -80 درجة مئوية. تمييع الثقافات المتبقية بين عشية وضحاها إلى وحدة تخزين النهائي من 50 مل في YNB، بما في ذلك 250 ميكرولتر من متوسط ​​نسبة الجلوكوز 20٪.لهذه الخطوة، فإنه من المهم أن نعمل على تخفيف تركيز السكر إلى ما يقرب من 0.1٪ (وزن / وزن) في الثقافة بسبب ارتفاع نسبة الجلوكوز يمكن قمع المروج GAL1 10. حيرة تنمو الثقافات في المسمى مخروطي 250 مل قوارير إلى OD 600 من 0،7-0،8 في 250 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية في حاضنة المدارية اهتزاز. حمل الثقافات من خلال اضافة 5 مل المتوسطة الجالاكتوز 20٪ على كل قارورة، وتنمو على لمدة 16 ساعة. تأكيد التعبير عن CFTR باستخدام المجهر مضان. أخذ 100 ميكرولتر من الثقافة وإضافة 100 الجلسرين ميكروليتر إلى الحد من تنقل الخلية في الحل. تحليل الخلايا على مجهر الرؤية دلتا استعادة RT (أو ما شابه)، وذلك باستخدام الليزر الأزرق تحت التصفية FITC (الطول الموجي من 490 نانومتر الإثارة وطول موجة من الانبعاثات من 528-538 نانومتر). وينبغي التعبير الإيجابي للانصهار بروتين CFTR-GFP تكون واضحة وحلقة من التألق في الغشاء البلازمي للخلايا الخميرة. ويمكن استخدام خلايا الخميرة Untransformed كمجموعة تحكم. نقلالثقافات في أنابيب الصقر 50ml. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 3500 XG، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق في مقعد أعلى الطرد المركزي. في حين أن أجهزة الطرد المركزي قيد التشغيل، وإعداد أنابيب microfuge 2 مل مع قمم المسمار التي تحتوي على ما يقرب من 500 ميكرولتر الخرز الزجاجي للحمض غسلها ومكان على الجليد. تجاهل supernatants وresuspend كل بيليه في 500-800 CRB المثلج ميكرولتر مع مثبطات الأنزيم البروتيني. نقل تعليق للأنابيب microfuge التي تحتوي على الخرز والحفاظ على الجليد. ليز الخلايا عن طريق هز بقوة / vortexing كل أنبوب microfuge لمدة 10 فترات من 30 ثانية، ويستريح على الجليد في ما بين الفترتين. ويمكن استخدام beadbeater كبديل، مثلا beadbeater BioSpec مصغرة تعمل لمدة 3 دقائق. وضع أنابيب في microfuge الفوق والطرد المركزي في 3500 XG، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. نقل supernatants التي تحتوي على عدد السكان غشاء الخام لتنظيف أنابيب microfuge ومكان على الجليد. إضافة 500 ميكروليتر جديدة الجليد المشتركLD CRB مع مثبطات الأنزيم البروتيني إلى كل أنبوب وتكرار هذه العملية لتجميع الأغشية. جمع الأغشية الخام الغزل في أقصى سرعة، 4 درجات مئوية في microfuge الفوق لمدة 2 ساعة. تجاهل طاف وresuspend كل بيليه في 50 العازلة الجليد CFTR الباردة ميكرولتر. في أنابيب microfuge نظيفة، وخلط 15 ميكرولتر من كل تعليق مع 15 ميكرولتر صبغ تحميل 2X بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. لا تغلي العينات، وهذا سوف يسبب بروتينات غشاء CFTR وغيرها لتشكيل SDS-غير قابلة للذوبان المجاميع وتفسد أيضا سمة GFP. تحميل عينات مع PageRuler زائد معايير بروتين prestained (Fermentas) على مادة هلامية 4-20٪ التدرج تريس / جليكاين (NuSep) وتشغيل عند 150 V لمدة 40 دقيقة أو حتى الجبهة صبغ هو في الجزء السفلي من الجل. التعرف على أعلى معربا عن الخلايا التي في جل مضان. مكان في نظام التصوير مضان مثل ماسح ضوئي الاعصار. مسح يو هلامغناء الليزر الأزرق في طول موجي للإثارة من 488 نانومتر، والطول الموجي الانبعاثات من 526 نانومتر. ينبغي للانصهار CFTR-GFP تكون واضحة في حوالي 220 كيلو دالتون. سيكون هناك أيضا فرقة فلوري ضعيفة وضوحا في حوالي 70 كيلو دالتون التي ربما هي خميرة جوهري FAD المحتوية على بروتين غشاء (مثل الوحيدات نازعة سكسينات A) 11،12. وصمة عار في هلام مع Coomassie، يزيل اللون ومسح هلام للمقارنة لفحص مضان باستخدام عرض صورة مريحة مجموعة من البرامج. الجل Coomassie الملطخة يسمح بتقييم نسبي من مستويات التعبير CFTR-GFP في مختلف خطوط نسيلي بعد تطبيع لكمية البروتين الكلي تحميلها على كل مسار من هلام. خط خارج خط خلية أعلى تعبير من المخزون الجلسرين لها (2.2) في الصعود إلى YNBA جديدة لوحة واحتضانها في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 2-3 أيام. قد ثم يتم تخزين هذه لوحة لمدة تصل الى 2 أسابيع في درجة مئوية 4 3. على نطاق واسع جهاز التخمير عبادةلدى عودتهم إعداد ما قبل الثقافات للتخمير. كشط 1cm 2 مجال الخلايا من YNBA لوحة (2.13) باستخدام حلقة عقيمة وإضافة إلى YNB مل 45 و 5 مل المتوسطة الجلوكوز 20٪، على ان يكون التطوير التنظيمي 600 هو 0.1 تقريبا. تنمو في 250 مل من قوارير مخروطي حيرة في 250 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية في حاضنة المدارية تهتز حتى تصل إلى 600 OD 1. انقسام بين اثنين من ثقافة مخروطي L 2 حيرة قوارير تحتوي كل منها على 450 مل و 25 مل YNB المتوسطة جلوكوز 20٪. تنمو هذه على نحو 250 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية في حاضنة المدارية تهتز حتى تصل إلى 600 OD 1.2. بينما هذه الثقافات ما قبل تنمو، وإعداد تخمير. جعل 11.2l من YNB كما هو موضح في 1.1، ولكن حل إضافي 8،28 ز YNB و 0.95 غرام التسرب تكملة للتعويض عن إضافة الجلسرين على الاستقراء. إضافة جو معقم و مطهر لل11،2 لتر YNB و 75 مل المتوسطة الجلوكوز 20٪ إلى سفينة تخمير 20L معقمة وضبط درجة الحرارة إلى تشغيل30 درجة مئوية. إضافة جو معقم و مطهر للprecultures للتخمير وتعيين سرعة التحريك إلى ما يقرب من 800 دورة في الدقيقة، والحفاظ على درجة الحرارة عند 30 درجة مئوية. وينبغي أن الهواء المضغوط يتدفق في ما يقرب من 15 دقيقة دسم 3 -1. وبمجرد أن يصل إلى ثقافة تخمير OD 600 من 1.2، حث بإضافة جو معقم و مطهر 1.5 لتر YNB حل الجالاكتوز 20٪ و 1.2 لتر الجلسرين. خفض درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية وتنمو ثقافة لمدة 16 ساعة. نقل محتويات تخمير إلى مبرد الطرد المركزي قدور 1L على الجليد باستخدام مضخة تمعجية. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3500 XG، 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في الدوار سعة كبيرة (على سبيل المثال 6 لتر). Resuspend الخلايا في 150 مل CRB الجليد الباردة مع مثبطات الأنزيم البروتيني. من هنا، ينبغي أن يتم العمل بها في كل درجة مئوية 4 ليز الخلايا التي يمر ديسروبتر ثابت الخلية الأنظمة في 4 تمريرات في 25 و 32 و 30 و 35 كيلو باسكال، وجمع والمحللة على الجليد في كل حالة على حدة. بدلا من ذلك، استخدم بيات حبةص (Biospec) مع حجم مساو من حامض يجرفها الخرز الزجاجي 0.5 ملم، وتستنهض الهمم لمدة 3 دقائق على كامل السلطة. نقل المحللة لأنابيب الصقر 50ml و بيليه حطام خلية بواسطة الطرد المركزي في 3500 XG، 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في جهاز للطرد المركزي الفوق. نقل وطاف على أنابيب الطرد المركزي المبردة. الطرد المركزي في 14000 XG، 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في جهاز للطرد المركزي لإزالة الميتوكوندريا. نقل طاف على أنابيب منبذة فائقة مبردة. الطرد المركزي في 200000 XG، 4 درجات مئوية لمدة 90 دقيقة في منبذة فائقة على جمع microsomes ل. صب بعناية والتخلص من طاف وإضافة 2ml العازلة CFTR الجليد الباردة مع مثبطات الأنزيم البروتيني وDTT 1MM على كل أنبوب. resuspend بلطف الكريات باستخدام فرشاة الرسام، وأعلى ما يصل كل أنبوب مع عازلة CFTR ومزيج باستخدام خلاط دوامة. منبذة التعليق على 200000 XG، 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة في منبذة فائقة، تجاهل الكريات طاف وresuspend في 2 مل الجليد الباردة ث العازلة CFTRمثبطات الأنزيم البروتيني إيث (لا DTT) باستخدام فرشاة الرسام. تجمع microsomes ل معلق، وتعديل حجم النهائي الى 50 مل مع عازلة CFTR وتخلط جيدا. الاحتياطي قسامة 1 مل لتحليل هلام SDS-PAGE، كما هو موضح في 2،9-2،11. يمكن أن تكون الآن microsomes ل فلاش مجمدة في النيتروجين السائل ثم تخزينها في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. ويمكن استخراج CFTR من microsomes ل باستخدام واحدة من المنظفات التالية: الليثيوم perfluorooctonoate حامض (LiPFO)، tetradecanoly-lyso-phosphatidylglycerol (LPG14)، N-دوديسيل-β-D-maltoside (DDM). تخلط مع microsomes ل العازلة CFTR، مثبطات الأنزيم البروتيني، والمنظفات بنسبة 5٪ (وزن / وزن). إذا تم استخدام DDM، إضافة أيضا 300 مم كلوريد الصوديوم إلى المخزن المؤقت. تستنهض الهمم في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على محور دوار أنبوب. منبذة العينات في 100000 XG، 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة في منبذة فائقة. تحتفظ طاف واتخاذ قسامة صغيرة لتحليل هلام SDS-PAGE. وربما تكون الآن CFTR يمكن تنقيته من المواد المعدنية التي solublised يجمدبعد التقارب اللوني بواسطة اللوني حجم الإقصاء. 4. ممثل النتائج التحول من الخميرة مع البلازميد CFTR المحتوية ليست فعالة بنسبة 100٪. وسيقوم ممثل صغار شاشة التعبير CFTR في المستعمرات المختارة من تجربة التحول تسفر عن 1 من كل 4 مستعمرات التعبير عن بروتين. ويبين نتيجة نموذجية من شاشة من 5 مستعمرات التقطت من لوحة في لوحة ألف من الشكل. 3. واحدة من المستعمرات يظهر بمستوى عال من التعبير عن انصهار بروتين CFTR-GFP الذي يمتد عادة بين 250 كيلو دالتون وعلامات كيلو دالتون 130، كما هو مبين. سوف CFTR-GFP مستويات مضان تختلف اختلافا كبيرا بين التجارب، مع مستعمرة 4 في الشكل. 3 عرض ما لا يقل عن 10X أكبر مضان من الفرقة فلوري جوهري في حوالي 70kDa. إذا كانت مستويات التعبير عن CFTR-GFP يبدو أن تعطي أقل مضان من الفرقة 70 كيلو دالتون، ومن ثم ربما تستحق إعادة تحويل واختيار مستعمرةمع مستويات أعلى من CFTR-GFP التعبير. كما هو مبين في الشكل. 3A، فإنه من غير المحتمل، حتى مع وجود مستوى عال من التعبير CFTR-GFP، أن الفرقة CFTR-GFP سيكون ملحوظ في استخراج الخلايا بواسطة تلطيخ Coomassie. مرة واحدة قد نمت المستعمرات المختارة في تجارب على نطاق أوسع، وmicrosomes ل معزولة، وجود CFTR-GFP داخل microsomes ل سوف تحتاج إلى تقييم، كما هو مبين في الشكل. 3B. نتائج هذه التجربة مهمة، ليس فقط لتقييم كفاءة تحريض التعبير، ولكن أيضا للتأكد من أنه تم إعداد microsomes ل بعناية و قد تم تصغير أن التحلل البروتيني. النتائج هو مبين في الشكل. 3B يعني أن في هذه التجربة التعبير CFTR-GFP أقل بعض الشيء (كما ترى نسبة إلى الفرقة 70kDa الذاتية) مما كان عليه في التجربة على نطاق صغير هو مبين في ألف لوحة ولكن منحازة هذا الانطباع من التعرض المفرط للكشف عن التألق في هذه قياس. وكان هذا لأن المجرب كان checkiنانوغرام عن وجود شظايا من بروتين CFTR بناء. هناك بعض الأدلة في هذه التجربة لبعض أجزاء بروتين فلوري بين 130 كيلو دالتون وعلامات كيلو دالتون 100، ولكن هذه هي ضعيفة جدا بالمقارنة مع الفرقة CFTR-GFP كامل طول. مع مثبطات الأنزيم البروتيني وصفها هنا، نجد القليل من الأدلة لتدهور بروتين من CFTR بعد كسر الخلية. إذا لوحظ التحلل البروتيني كبيرا، نوصي جعل الطازجة حلول الأوراق المالية البروتيني المانع. لقد وجدنا أيضا أن تجاري أقراص كوكتيل البروتيني المانع ليست فعالة كما لهذا النظام. نمو الخلايا بعد 16 ساعة وسوف (ما بعد الاستقراء) أن تؤدي إلى التعبير CFTR انخفضت كما هو مبين في الشكل (4). هذا ربما يرجع إلى دوران من البروتين، وربما بسبب upregulation من آلية بروتين خميرة مراقبة الجودة 6-9،13. ولذلك يستحسن لرصد مستويات التعبير CFTR بعد الاستقراء مع الجلاكتوز، إذا كان ذلك ممكنا، حيث أن الوقت الأمثل لحصاد الخلايا أماهذ تختلف من مختبر إلى آخر. الشكل 1. إن البناء المحتوية على الخميرة CFTR البلازميد. يتم إدراج الانصهار CFTR-GFP-8His في ناقلات 2μ التعبير p424GAL1، تحت سيطرة أحد المروجين (GAL1) الجالاكتوز. الموجه يحتوي أيضا على علامة اختيار اليوراسيل (URA) والجينات المقاومة الأمبيسيلين (الأمبير). الشكل 2. مخطط انسيابي تلخيص بروتوكول تصور. الشكل 3. ممثل SDS-PAGE المواد الهلامية التعبير CFTR وتنقيتها. لوحة ويظهر 5 اختار عشوائيا المستعمرات transformant (الممرات 1-5) التي تم فحصها للكشف عن التعبير CFTR. لوحة يظهر microsomes ل B التي تم عزلها من آلية سعر الصرف الثابت 15Lأدخل ثقافة. لوحة C يظهر تنقية CFTR الفئران التي تم الحصول عليها بعد مرحلتين تنقية باستخدام اللوني التقارب اللوني تليها حجم الإقصاء. وتظهر جميع المواد الهلامية في ظل ظروف إضاءة مضان مثيرة من المجال GFP (يسار) وبعد Coomassie صمة عار (يمين). يتم سرد المواقع النسبية لمعايير الوزن الجزيئي على اليسار (قده). الشكل 4. بيانات تمثيلية للتعبير عن CFTR في الخميرة. لوحة ويظهر مرة وبالطبع التعبير CFTR بعد الاستقراء مع اللبن. وقد تم تحليل مستخلصات الخلية بواسطة SDS-PAGE، وتتكامل في ما بينها ومضان GFP للفرقة بروتين CFTR-GFP. B لوحة تظهر نتائج نموذجية للفحص المجهري مضان من GFP، معربا عن الخلايا الاستقراء آخر 16 ساعة. عادة، سوى جزء صغير من الخلايا التعبير عن CFTR عند مستويات مرتفعة.