Versuche, die zystische Fibrose Transmembran Regulator (CFTR) in Ausdruck<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Haben, bis jetzt, ergab relativ geringe Mengen an Protein. Dieses Protokoll und die damit verbundenen Reagenzien über die Mukoviszidose-Stiftung verteilt sollte ermöglichen die Herstellung von Milligramm-Mengen dieser "schwierigen" eukaryontischen Membranprotein.
Die zystische Fibrose Transmembran Regulator (CFTR) ist ein Chlorid-Kanal, die im Fall einer Mutation entstehen Mukoviszidose in humans.There geben können, ist daher ein großes Interesse in diesem Protein, aber die Bemühungen um die Struktur und Aktivität zu untersuchen haben, durch die Schwierigkeit behindert worden Expression und Aufreinigung von ausreichenden Mengen des Proteins 1-3. Wie viele "schwierige" eukaryotischen Membranproteine, ist Ausdruck in einer schnell wachsenden Organismus wünschenswert, aber eine Herausforderung, und in der Hefe S. cerevisiae, so weit geringe Mengen erhalten und einen schnellen Abbau des rekombinanten Proteins wurde 4-9 beobachtet. Proteine, die in der Verarbeitung von rekombinanten CFTR in Hefe beteiligt wurden 6-9 beschrieben. In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Expression des CFTR in Hefe und dessen Reinigung in signifikanten Mengen. Das Protokoll beschreibt, wie die früheren Proteolyse Probleme überwunden werden können und wie Expression vonCFTR läßt sich durch Änderung der Bedingungen und Zellwachstum durch die Kontrolle der Induktionsbedingungen verbessert werden, insbesondere die Zeit vor der Zellernte. Die reagants mit diesem Protokoll (murine CFTR-exprimierenden Hefezellen oder Hefeplasmide) wird über den US-Cystic Fibrosis Foundation, die die Forschung gefördert hat, verteilt werden assoziiert. Ein Artikel beschreibt das Design und die Synthese des CFTR in diesem Bericht verwendeten Konstrukt wird getrennt veröffentlicht (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, unveröffentlicht). In diesem Artikel erklären wir Ihnen, unsere Verfahren beginnend mit der Transformation der Hefezellen mit dem CFTR-Konstrukt – haltigen Hefe-Plasmid (Abb. 1). Das Konstrukt ist ein grün fluoreszierendes Protein (GFP)-Sequenz fusioniert am C-Terminus CFTR und folgt dem System von Drew et al. (2008) 10. Das GFP erlaubt die Expression und Reinigung von CFTR zu relativ leicht verfolgt werden. Die JoVE visualisiert Protokollol endet nach der Herstellung von Mikrosomen, die aus den Hefezellen, obwohl wir auch einige Vorschläge zur Reinigung des Proteins aus den Mikrosomen sind. Leser können auf Wunsch ihre eigenen Änderungen der Mikrosomen Reinigungsverfahren, abhängig von den endgültigen Experimente mit dem Protein und der lokalen Einrichtung steht, um sie durchgeführt werden hinzuzufügen. Die Hefe exprimierten CFTR-Protein teilweise gereinigt werden, indem Metallionen-Affinitätschromatographie unter Verwendung einer intrinsischen Polyhistidin-Tag Reinigung. Nachfolgende Größenausschlusschromatographie ergibt ein Protein, das als> 90% rein, wie durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung des Gels beurteilt wird.
Dieses Papier stellt ein Verfahren für die Expression von murinem CFTR-Protein in Hefezellen, welche die Forschung an Mukoviszidose sollte zu erleichtern. Ziel ist es, dieses Papier mit der Veröffentlichung des murinen CFTR-DNA-Konstrukt, das erhältlich sein wird durch die Mukoviszidose-Stiftung (Link http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Andere Orthologe sollten verfügbar sein später. Die Transformation der Hefezellen mit dem CFTR-enthaltenden Vektor ist einfach, aber es ist wichtig zu screenen Kolonien, die hohe Konzentrationen von CFTR. Variable Expression kann von mehreren Faktoren ergeben, aber die Anzahl der Kopien des Plasmids pro Zelle wahrscheinlich für eine beträchtliche Unterschiede. Kritische hier beschriebenen Schritte sollte es die Produktion von CFTR-exprimierenden Hefezellen und CFTR-haltigen mikrosomalen Membranen. Nachdem die Transformation, Wachstum, Ernte und Lyse von Hefezellen wurden gemeistert, purifTZBEREICH des Proteins möglich sein sollte, und in Abbildung 3 haben wir ein Beispiel für die Reinheit, die erreichbar sein sollten in diesem Fall als nützliche Benchmark gegeben. Es ist nicht unsere Absicht, in dieser Handschrift, um detaillierte Methodik für die Reinigung des Proteins liefern. Es gibt jedoch einige kritische stromabwärtigen Reinigungsschritte, die spezifisch für die S.cerevisae Expressionssystem, wie Zell-Lyse und Aufreinigung Mikrosomen sind, und diese sind im Detail in dieser Handschrift aufgenommen. Es sollte erwähnt werden, jedoch, dass abgesehen von den beiden Methoden, die wir verwendet haben, können alternative Hefezelle Aufschlussverfahren eingesetzt werden, wie die Verwendung eines Französisch Druckzelle werden. Das rekombinante Protein eine TEV-spaltbare C-terminalen GFP-Domäne, die das Protein nach der Induktion verfolgt werden (Abb. 4) ermöglicht. Hefe haben einen intrinsischen 70kDa Protein (wahrscheinlich Succinatdehydrogenase 12), dass fluoresziert unter den gleichen Bedingungen 11, und damit ein sinnvoller inter bieteninterne Kalibrierung Maß für die relative Expression von CFTR in Ganzzellextrakten oder Mikrosomen (Abb. 3). Es ist klar, aus den Daten in 4 gezeigt, dass der Zeitpunkt der Zellernte nach Induktion mit Galactose von entscheidender Bedeutung ist. Ausbeuten von CFTR Tropfen steil nach etwa 16 Stunden der Induktion, so dass es wird praktisch kein nachweisbares CFTR in Hefe-Zellen nach 24 Stunden der Induktion.
Die Ausbeute an gereinigtem Protein ist etwa 1-2mg CFTR-Protein pro 15 Liter-Fermenter Kultur. Die Wiederherstellung kann etwa 70% der gesamten CFTR-GFP-Protein bis zu der Mikrosomen Stadium davon ausgegangen werden, und etwa 25% Gewinnung von gereinigtem Protein. Charakterisierung des S. cerevisiae-ausgedrückt CFTR ist im Gange. Wie in ersichtlich. 4, kann das Protein die Stelle in der Zelle durch Fluoreszenz-Mikroskopie beobachtet werden. Obwohl ein Großteil der Fluoreszenz in der Umgebung der Peripherie der Zelle als erwarteten 10 gefunden wird, wird etwas von dem Protein ein punktförmiges Körperregion, entweder in odergerade innerhalb der Plasmamembran, die möglicherweise durch das Recycling durch einen späten Golgi / endosomalen Weg 14 oder vielleicht einem Fach hinter der Knospung der Vesikel von der ER 4 CFTR konnte. Die Behandlung mit PNGaseF, ein Enzym, das Proteine deglycosylates, zeigten eine minimale Änderung in der Migration des CFTR-Protein-Bande auf SDS-PAGE, was bedeutet, dass es glykosyliert ist oder eine minimale Glykosylierung 15. Versuche über die Phosphorylierung des Proteins sind im Gange. In einigen der Wasch bisher getesteten, zeigt das gereinigte Protein ATPase-Aktivität (dh durch ein CFTR-spezifischer Inhibitor inhibiert 16) mit Raten, die ähnlich zu den zuvor veröffentlichten 2,15 sind. Messung der CFTR-Kanal Aktivität erforderlich Rekonstitution des gereinigten Proteins, das eine letzten Reinigungsschritt in einem Reinigungsmittel, das eine relativ hohe kritische Mizellenkonzentration (CMC) 17 weist bedeuten würde. Hefe-Mikrosomen containing CFTR kann mit verschiedenen üblicherweise eingesetzten Reinigungsmittel 18, einschließlich Detergenzien wie Dodecylmaltosid 2, die im Allgemeinen gelten als "mild" solublised werden. Doch die meisten hohen CMC Waschmittel haben sich als ineffizient für solubilsation, so weit, was darauf hindeutet, dass der Austausch in dieser Waschmittel in einem späten Stadium in irgendeiner Reinigungsschema sollte erwogen werden.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken der Cystic Fibrosis Foundation (CFF) zur Finanzierung dieser Arbeit durch seine 3D-Struktur CFTR Consortium (Grant Number FORD08XX0). Wir erkennen den enormen Beitrag von allen Kolleginnen und Kollegen innerhalb des Konsortiums zu dieser Arbeit, insbesondere in der Gestaltung der CFTR-Gene. Wir erkennen auch die wertvollen Beiträge von Drs. James Birtley (NCSR Demokritos, Griechenland), Mark Young (University of Cardiff, UK) und David Drew (Imperial College, London, UK) in den frühen Phasen der Arbeit. Besonders danken wir Dr. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |