Summary

תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

Published: April 02, 2012
doi:

Summary

הפרוטוקול מתאר את מערכת מודל יעיל לשחזור ללמוד הרפס סימפלקס סוג הנגיף 1 (HSV-1) ההשהיה מחדש. Assay מעסיקה הומוגניות תרבויות נוירונים אוהדים ומאפשר לנתיחה מולקולרית של וירוסים נוירונים אינטראקציות באמצעות מגוון של כלים, כולל התערבות RNA וביטוי של חלבונים רקומביננטיים.

Abstract

הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) קובע דלקת כל החיים סמויה בנוירונים פריפריאליים. זה המאגר סמויה היא המקור של אירועים חוזרים מחדש כי להבטיח שידור ולתרום מחלה קלינית. אנטי הנוכחי אין השפעה על המאגר סמויה ויש חיסונים לא. בעוד את הפרטים המולקולריים של שכפול ממס הם מאופיינים היטב, מנגנוני השליטה חביון בנוירונים להישאר חמקמקה. ההבנה הנוכחית שלנו של חביון נגזר במחקרים vivo תוך שימוש במודלים של בעלי חיים קטנים, אשר היו הכרחיים להגדרת דרישות גנים נגיפיים ואת התפקיד של המערכת החיסונית. עם זאת, אי אפשר להבחין בין השפעות ספציפיות על היחסים וירוסים נוירון מ השלכות כלליות יותר של זיהום בתיווכו של תאים חיסוניים תמיכה או לא העצבית בעלי חיים. בנוסף, ניסויים בבעלי חיים הוא יקר, זמן רב, ומוגבל מבחינת האפשרויות הזמינות עבור מניפולציה מארחתהליכים. כדי להתגבר על המגבלות האלה, מערכת העצב בלבד יש צורך נואש זה מתרבה במאפייני vivo של חביון מחדש אבל מציע את היתרונות של התרבות רקמת מבחינת ההומוגניות ונגישות.

כאן אנו מציגים מודל במבחנה תוך שימוש בתרבית נוירונים אוהדים העיקרית מן הגרעינים עכבר מעולה צוואר הרחם (SCG) (איור 1) ללמוד HSV-1 חביון מחדש המתאימה ביותר, אם לא כל הקריטריונים הרצויים. לאחר ביטול שאינם עצביים תאים, כמעט הומוגנית TrkA + תרבויות נוירונים נגועים HSV-1 בנוכחות acyclovir (ACV) לדכא את שכפול ממס. הסרת הבאה ACV, לא פרודוקטיביים HSV-1 זיהומים בנאמנות התערוכה סימני ההיכר המקובלים חביון מבוססים ביעילות. יש לציין, mRNAs ממס, חלבונים, וירוס מדבק להיות בלתי ניתן לגילוי, גם בהיעדר בחירה, אבל ההשהיה הקשורים (LAT) תעתיק אקספרסיון מתעקש גרעינים העצבית. הגנום הנגיפי נשמרים במספר עותק ממוצע של 25 לכל תא עצב יכול להיגרם פרודוקטיבית לשכפל ידי הפרעה PI3-kinase / Akt איתות או נסיגה פשוטה של גורם הגדילה העצבי 1. רקומביננטי HSV-1 EGFP קידוד קיבע את החלבון הנגיפי Us11 ממס מספק פונקציונלי, בזמן אמת סמן שכפול כתוצאה מחדש כי הוא לכמת בקלות. בנוסף טיפולים כימיים, שיטות גנטיות כגון משלוח RNA-הפרעות או הגן באמצעות וקטורים lentiviral ניתן ליישם בהצלחה למערכת המתיר מחקרים מכניסטית שקשה מאוד, אם לא בלתי אפשרי, אצל בעלי חיים. לסיכום, SCG מבוסס HSV-1 חביון / הפעלה מחדש המערכת מספקת כלי רב עוצמה, צריך לפענח את המנגנונים המולקולריים השולטים HSV1 חביון מחדש בנוירונים, פאזל ארוכת ב וירולוגיה שפתרונה עשוי להציע תובנות חדשות בפיתוח טיפולים חדשים המטרה לאהוא רדום מאגר ההרפס.

Protocol

1. בידוד והתרבות של הנוירונים SCG מעוברים עכברוש כדי לספק הקשר שימושי להבנת בפרוטוקול זה, וגם לדיון מקיף בספרות קודם לכן בשיטות שנקבעו התרבות נוירון SCG, כולל בסיס SCG בתרבות חוץ גופית, צלחת ציפוי מצעים, ואת מרכיבי סרום ללא מדיה, הקורא…

Discussion

זו תרבות הנוירון הראשוני המערכת זיהום מספק שיטה פשוטה ויעילה לבדוק את המנגנונים המולקולריים שבבסיס HSV-1 חביון מחדש. המערכת בנאמנות משחזר את סימני ההיכר המקובלים חביון שהוגדרו הן זיהומים האדם והן לחיות מודלים של בעלי חיים. כאשר הנגיף רדום בתרבויות SCG, חלקיקים…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים הסוקרים לקבלת הצעות חושבים שלהם זה עזר כדי לשפר את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ל MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) ו-IM (AI073898, GM056927) מ-NIH. ח"כ נתמך בחלקו על ידי מענק אימון NIH (5T32 AI007180).

Materials

Reagent Company Catalog# Comments
70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350  
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080  
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
96-well flat well bottom TC plates Corning 3599  
Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
B-27 Supplement Invitrogen 17504-44  
Collagenase Sigma C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
D-(+)-Glucose Sigma G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
L-Glutamine Invitrogen 25030-081  
Laminin Sigma L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415  
Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
Neurobasal medium Invitrogen 12348  
Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Rat-tail collagen Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
Trichostatin A Sigma T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04  

Riferimenti

  1. Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
  2. Johnson, M. I., Fedoroff, S., Richardson, A. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 71-94 (2001).
  3. Letourneau, P. C., Fedoroff, S., Richardson, A. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. , 245-254 (2001).
  4. Price, J. P., Brewer, G. J., Fedoroff, S., Richardson, A. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , 255-264 (2001).
  5. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of virology. , (2008).
  6. Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. 2, 2381-2397 (2001).
  7. Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
  8. Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
  9. Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
  10. Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
  11. Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
  12. Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).
  13. Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O’Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
  14. Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
  15. Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
  16. Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
  17. Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
  18. Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
  19. Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
  20. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
  21. Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
  22. Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
  23. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
  24. Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
  25. Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
  26. Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
  27. Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , (2012).

Play Video

Citazione di questo articolo
Kobayashi, M., Kim, J., Camarena, V., Roehm, P. C., Chao, M. V., Wilson, A. C., Mohr, I. A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation. J. Vis. Exp. (62), e3823, doi:10.3791/3823 (2012).

View Video