时间和空间上的基因表达分析在功能基因组学的重要作用。全挂载杂交<em>原位</em>是用于确定本地化组织和亚细胞车厢内的成绩单。在这里,我们勾勒1杂交<em>原位</em>蚊子的具体目标组织的修改协议。
蚊子是一套不同的病原体,包括虫媒病毒,原虫和线虫的媒介。在组织中的蚊子宿主和病原体相互作用,参与繁殖器官的极大兴趣战略,以减少蚊子传播的疾病传播和破坏卵的发育表达的转录和基因调控的研究。已经有许多工具时空和组织特异性基因表达调控的研究和验证。在这里,我们描述了已开发的协议,以获取空间信息,从而提高我们了解特定基因的表达和他们的产品积累。描述的协议已被用来验证的表达和蚊子传播的病原体传播有关的组织,如女性的唾液腺,以及卵巢和胚胎细胞内的车厢,确定誊积累模式,重新晚蚊子的繁殖和发展。
下列程序代表一个优化的方法,在协议中的各项步骤的效率提高没有特定目标的杂交信号的损失。 RNA探针的制备准则,软组织的解剖和一般的固定和杂交过程描述在A部分,B部分详细而具体步骤的收集,固定,预杂交和杂交蚊子胚胎中
提出了整个安装蚊子组织和胚胎在原位和色度染色协议的杂交,是一个有用的技术,在特定器官和细胞类型的转录本地化。这些程序是一个比我们以前报道的方法,无论是在精简广泛的洗涤步骤,并提供更多的技术细节和试剂来源的改善。
根据我们的经验,比色法检测杂交信号杂交信号的灵敏度和清晰度优于基于荧光检测计划。此外比色法检测绕开了胚胎,这是本质上的自动荧光信号歧视的问题。检测杂交信号的局限性发生时,低丰度转录的针对性和背景染色是显而易见的。杂交温度提高到65°C已被发现,以减少回地面的杂交信号,但并不是唯一的目标特定的RNA探针设计的建议替代。
该协议已被用来执行整个安装唾液腺,埃及伊蚊和冈比亚按蚊,按蚊,AE的卵巢和胚胎原位杂交。埃及斑蚊和致倦库蚊 。这种方法也适用于其他蚊虫的组织,想必其他昆虫。此外,我们还首次为三个病媒蚊,AE在胚胎发育分期的比较准则编制。埃及斑蚊,安。冈比亚和CX。 fatigans。谨慎饲养条件下,这三个品种的特定菌株已报告的意见。重要的是要注意,不同蚊种的不同菌株,不同饲养条件下发育的时间当然可以。 在原位补充杂交持续努力向全日空lyze蚊子和其他节肢动物的转录,并可能在这些微生物的基因表达调控提供更好的画面。
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢在发展杂交意见玛丽卡·沃尔特斯的协议进行讨论冈比亚按蚊的胚胎,随后调整和修改开发协议, 在这里介绍杂交原位杂交在软组织和尤里Goltsev的原位方法伊蚊和致倦库蚊胚胎原位 。我们也承认亚当·PARE和大卫Kosman的有益建议。我们感谢奥斯瓦尔多Marinotti科学讨论和编辑的协议文本。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
0.5 M EDTA | Ambion | AM9261 | |
1M Tris-HCl | Ambion | AM9855G | pH8.0 |
10X PBS | Ambion | AM9625 | |
20X SSC | Ambion | AM9763 | |
1.5 ml microfuge tubes | Ambion | AM12400 | Less opaque than standard tubes; aids in visualizing samples |
Deionized formamide | Ambion | AM9342 | Storage at 4 °C |
DEPC water | Ambion | AM9932 | |
Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
5.25% Sodium hypochlorite | Austin’s | A-1 Brand | |
T3 RNA Polymerase-Plus | Ambion | AM2733 | Storage at -20 °C |
T7 RNA Polymerase | Ambion | AM2082 | Storage at -20 °C |
95% Ethanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
Fisherbrand disposable polyethylene transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
HPLC-grade methanol | Fisher Scientific | A452-1 | |
Magnesium chloride | Fisher Scientific | M87-500 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-542A | 18 x18 mm |
N-Heptane | Fisher Scientific | H350-1 | |
P-xylene | Fisher Scientific | O5082-500 | |
Pyrex 9-well Spot Plate | Fisher Scientific | 13-748B | 100×85 mm |
Sodium chloride | Fisher Scientific | AC32730-0025 | |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255-1 | |
Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0 mm |
Davlyn Red Clear-liner Toupee tape | Hair Direct | RED-75R12 | Poly/Skin base material 0.75 in x 12 yd tape roll |
TOPOTA Cloning Kit for Sequening with One Shot Top10 chemically-competent E. coli | Invitrogen | K457501 K457540 | 20 reactions 40 reactions |
Sonicated salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | Storage at -20 °C |
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche Applied Science | 1093274 | Storage at 4 °C |
DIG RNA labeling mix | Roche Applied Science | 1277073 | Storage at -20 °C |
NBT/BCIP stock solution | Roche Applied Science | 1681451 | Storage at 4 °C |
Western Blocking Reagent | Roche Applied Science | 11921673001 | Storage at 4 °C |
Saatilene Hitech polyester mesh (330.130) | Saati Print | 330.34 UO PW | 330 threads/inch, 34 micron thread diameter, orange color |
Glycerol | Sigma | G6279-1 | 70% in PBT |
Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
Tween 20 | Sigma | P1379-500 | |
37% Formaldehyde | Ted Pella | 18508 | 10 ml aliquots in amber ampoules |
16 oz. Solo Paper containers with lids | The Paper Company | SOLOKH16AJ8000 | |
Borosilicate glass scintillation vial with unattached screw cap | VWR International | 66022-128 | 20 ml case of 500 |
Sealed Air Bubble wrap celluar cushioning material | VWR International | 500018-081 | 10 foot/roll 0.188 inches thick |
Chicken serum | Whole blood was collected either from the wing vein or by cardiac puncture from a juvenile chicken. Blood was incubated at 37 °C for 1 h until coagulated and then placed on ice for 30 min. The serum was collected and centrifuged at 3000 x g for 10 min. The resulting supernatant (clarified serum) was collected and stored at -20 °C until use. |
Table 4. Table of specific reagents and equipment for hybridization in situ.