Summary

Medição de γHV68 Infecção em Camundongos

Published: November 22, 2011
doi:

Summary

γ-Herpesviruses (γ-HVS) estabelecer ao longo da vida a persistência em seus hospedeiros. Infecção de camundongos com γ-HV68 oferece uma geneticamente tractable<em> In vivo</em> Modelo para a caracterização do ciclo de vida / patogênese da γHVs. Este protocolo descreve a detecção e quantificação de γHV68 infecção em fase aguda e após a infecção latente por placas formadoras de centro, infecciosas, e ensaios de qPCR.

Abstract

γ-Herpesviruses (γ-HVS) são notáveis ​​por sua capacidade de estabelecer infecções latentes de células linfóides 1. A gama de hospedeiros humanos estreito de γ-HVS, como EBV e KSHV, foi severamente prejudicado estudos detalhados patogênicos. Murino γ herpesvirus-68 (γHV68) ações extensa semelhanças genéticas e biológicas humanas com γ-HVS e é um patógeno natural de roedores murids 2. Portanto, a avaliação de γHV68 infecção de camundongos cepas puras em diferentes estágios da infecção viral fornece um modelo importante para a compreensão do ciclo de vida viral e patogênese durante γ-HVs infecção.

Após inoculação intranasal, γHV68 infecção resulta em viremia aguda no pulmão, que é posteriormente resolvido em uma infecção latente de esplenócitos e outras células, que pode ser reativada ao longo da vida do hospedeiro 3,4. Neste protocolo, vamos descrever como usar a placa de ensaio para avaliars título de vírus infeccioso no pulmão homogeneizados em monocamadas de células Vero na fase inicial (5-7 dias) do pós-infecção intranasal (dpi). Quando a infecção aguda é em grande parte limpa 2-3 postinfection semanas, uma infecção latente de γHV68 é estabelecida em torno de 14 dpi e mantido posteriormente no baço dos camundongos. Infecção latente geralmente afeta uma população muito pequena de células nos tecidos infectados, segundo o qual o vírus permanece latente e desliga a maioria de sua expressão gênica. Esplenócitos latentemente infectadas pelo vírus espontaneamente reativar sobre explanting em cultura de tecidos, que pode ser reproduzido por um centro de ensaio infecciosas (IC) para determinar a carga viral latente. Para melhor estimar a quantidade de cópias do genoma viral na forma aguda e / ou tecidos infectados de forma latente, quantitativa PCR em tempo real (qPCR) é usado para a sua sensibilidade máxima e precisão. As análises combinadas dos resultados da qPCR e placa de ensaio, e / ou ensaio IC irá revelar os perfis espaço-temporal de viralreplicação e infectividade in vivo.

Protocol

O protocolo a seguir irão descrever o estudo dos títulos de vírus e de cargas genoma viral no ciclo de infecção lítica e latente de γHV68 em camundongos, o que teoricamente pode ser usado para avaliar a infecção por outros vírus partilha estilo de vida semelhante ao de γHV68. 1. Amplificação de γHV68 Descongelar um frasco frozen da γHV68 em 37 ° C banho-maria. Adicionar inóculo viral para NIH3T12 ou cultura de células 3T3 (~ 50% confluência) em 10 prat…

Discussion

γHV68 tem sido amplamente utilizado como modelo para compreender a patogênese da humana γ-HVs 2,4,5. Neste protocolo, descrevemos três métodos rotineiramente usados, incluindo ensaio de placa para o título de vírus infecciosos, teste de IC para carga viral latente, e qPCR para carga genoma viral, para avaliar a infecção aguda e latente de γHV68 após a inoculação intranasal em camundongos.

O ensaio de placa tem sido amplamente utilizado para determinar o título de ví…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a assessoria técnica e apoio de Ren Sun (University of California, Los Angeles) e Hwang Seungmin (Washington University). Este trabalho foi financiado pela Fundação Baxter, National Institutes of Health subvenções (R01 e R21 CA140964 AI083841 para C. Liang).

Materials

Material Name Preparation Procedure
Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay
  1. Heat ~ 250 ml of distilled water in TC bottle to > 80°C (boiling for 3 min in microwave)
  2. Add gradually 2.5 g MC powder into heated water, stirring over low heat until dissolved.
  3. Autoclave immediately for 15 min at liquid cycle.
  4. Stirring the autoclaved MC media at 4°C overnight.
  5. Combine 250 ml MC media with 200ml 2 x MEM (Gibco-BRL) + 50 ml FBS to give 500 ml overlay media.
Fix/stain medium for plaque assay 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol.
ACK Lysis Buffer NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM
Complete DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL).

Table 1. Specific media used in this protocol

Name of the reagent Company Catalogue number
Ketamine Sigma-Aldrich K2753
Xylazine Sigma-Aldrich X1251
Methylcellulose Sigma-Aldrich M0512-250g
2 x MEM Life Technologies 11935
Cell strainer BD Faclon 352340
Omni tissue homogenizer OMNI International TH115
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
iQTM SYBRH Green Supermix BioRad 170-8882
CFX96 real-time PCR system Bio-Rad 184-5072
Cell counter Bio-Rad 145-0001
Sorvall SA-600 Thermo Scientific 096-124022

Table 2. Specific reagents and equipment

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Pirooz, S. D., Lee, J., Zhao, Z., Ni, D., Oh, S., Liang, C. Measurement of γHV68 Infection in Mice. J. Vis. Exp. (57), e3472, doi:10.3791/3472 (2011).

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