Een compartimentering microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van kanker stamcellen migratie wordt beschreven. Deze roman platform creëert een levensvatbare cellulaire micro-omgeving en maakt microscopische visualisatie van levende cellen voortbewegen. Zeer beweeglijke kankercellen worden geïsoleerd om moleculaire mechanismen van agressieve infiltratie, wat kan leiden tot een meer doeltreffende toekomstige therapieën te bestuderen.
In de laatste 40 jaar, de Verenigde Staten meer dan 200 miljard dollar geïnvesteerd in onderzoek naar kanker, wat resulteert in slechts een daling van 5% in sterfte. Een belangrijk obstakel voor het verbeteren van patiëntresultaten is het slecht begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan cellulaire migratie geassocieerd met agressieve kankercel invasie, metastasering en therapeutische resistentie 1. Glioblastoma multiforme (GBM), de meest voorkomende primaire kwaadaardige volwassen hersentumor 2, is een voorbeeld van dit probleem. Ondanks standaard chirurgie, bestraling en chemotherapie, patiënten mediane overleving is slechts vijftien maanden, als gevolg van agressieve GBM infiltratie in aangrenzende hersenen en snelle kanker terugkeert 2. De interacties van afwijkende cellen trekkende mechanismen en de tumor micro-omgeving waarschijnlijk onderscheiden kankercellen van normale cellen 3. Het verbeteren van therapeutische benaderingen voor GBM vereist een beter begrip van kanker celmigratie mechanismen. Recent onderzoek wijst erop thata kleine subpopulatie van cellen in GBM kan de hersentumor stamcellen (BTSC), verantwoordelijk voor therapeutische weerstand en herhaling. Onderliggende mechanismen van BTSC trekkende capaciteit nu pas een begin worden gekenmerkt 1,4.
Door een beperking in visueel onderzoek en geometrische manipulatie conventionele migratie assays 5 beperkt tot kwantificeren totale celpopulaties. In tegenstelling, microfluïdische apparaten toestaan single cell analyse vanwege compatibiliteit met moderne microscopie en controle over de micro-omgeving 6-9.
We presenteren een methode voor gedetailleerde karakterisering van BTSC migratie met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten. Deze PDMS-en-klare apparaten wierp de weefselkweek omgeving in drie verbonden compartimenten: zaaien kamer, ontvangst kamer en het overbruggen van microkanalen. We toegesneden het apparaat zodanig dat beide kamers voldoende media houden om levensvatbare BTSC ondersteuning voor 4-5 days zonder media-uitwisseling. Zeer mobiele BTSCs eerste instantie in de seeding kamer worden geïsoleerd na de migratie wel overbruggen microkanalen op de parallelle opvangkamer. Deze migratie simuleert kanker cellen verspreid door de interstitiële ruimten van de hersenen. De fase live beelden van celmorfologie tijdens de migratie worden opgenomen over meerdere dagen. Over grote afstanden trekkende BTSC kan dus geïsoleerd, recultured, en geanalyseerd verder.
Compartimentering microfluidics kan een veelzijdig platform om het trekgedrag van BTSCs en andere kanker stamcellen te bestuderen. Door het combineren gradiënt generatoren, vloeistofverwerking, micro-elektroden en andere microfluïdische modules kunnen deze inrichtingen ook worden gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen en diagnose van de ziekte 6. Isolatie van een agressieve subpopulatie van migrerende cellen van studies van de onderliggende moleculaire mechanismen.
De microfluïdische apparaat en beeld-opnametechniek hier gepresenteerde maakt een visuele karakterisering van cellulaire morfologie tijdens de migratie. In vergelijking met bestaande conventionele methoden, de microfluïdische platform biedt voordelen van kosteneffectiviteit, high throughput en design flexibiliteit. De gepresenteerde microscopische visualisatie systeem maakt studie en opnemen van langdurige levende celmigratie. De lens-gemotoriseerde functie maakt het mogelijk om meerdere migratie paden te volgen in een hoge beeld-resolutie zonder verstoring van het monster.
Tijdens assemblage van de inrichting, de PDMS stempel niet vast op de glazen dekglaasje voor het gemak van PDL coating (stap 3.4). Is het essentieel om een goede afdichting voor het succes van dit protocol bereiken. Verontreiniging die vanaf het apparaat fabricage, zoals luchtbel in de stempel of stof / vuil op het substraat kan brengen de hechting en resulteren in het weglekken van vocht. Daarom TREATIng van het apparaat in een stofvrije manier is belangrijk om te voorkomen dat apparaat defect. Voorafgaand aan de PDL-coating, de dekglaasjes zijn salpeterzuur behandeld en de oplossing wordt gecentrifugeerd PDL stof / vuil te verwijderen. We vinden Scotch tape, alcohol spoelen, en waterbad zeer behulpzaam bij het verwijderen van stof / puin van de PDMS stempel, als een schone kamer is niet toegankelijk. Na de PDMS stempel maken van contact met het glas dekglaasje, het aanboren van de stempel voorzichtig met een pincet vergemakkelijkt de afdichting.
BTSCs kan worden verrijkt door menselijke operatiekamer exemplaren via bol cultuur in stamcel medium, vergelijkbaar met de cultuur van de normale neurale stamcellen 10. BTSCs verrijkt op deze manier tonen stamcelachtige eigenschappen, zoals expressie van markers stamcellen (CD133, nestin), differentiatie meerdere neurale lineages (gliale en neuronale) en tumorinitiatie in een orthotope immunodeficiënte muismodel met zo weinig als 100 cellen 18. Hoewel enige discussie bestaat over zuiveringcatie en het onderhoud van BTSCs 1, 19-21, bol-grown BTSCs beter behouden het fenotype en genotype van de ouders tumor 22-24.
De gecompartimenteerde ruimte bootst de fysiologische omgeving voor cel migratie. In ons apparaat, BTSC vertonen een sterke capaciteit van migratie door middel van een op grootte beperkte ruimte door het reguleren van cellulaire morfologie. Onze karakterisering van de cel morfologische veranderingen geeft mode-transformaties in een zestal theaterproducties sequentie die een mogelijke nieuwe gedetailleerde beschrijving van BTSC invasie van aangrenzende hersenen kan modelleren. In vroege stadia de cellen een aanmerkelijk hoeveelheid polariteit en genereren kleefstof effectief uitsteeksels zich verankeren in het microkanaal. Zodra de cel bezetting in de microkanaal is gevestigd, het converteert naar een cruise-modus en onderhoudt deze modus voor de volledige reis door een microkanaal. In dit stadium, BTSC behoud van een hoge beweeglijkheid en consistente richting, maar energie te besparen. Interestingly blijkt dat een microkanaal beperkt tot een cruising cel tegelijk, zodanig dat wanneer een cel door naar dit stadium andere cellen terugtrekken uit het microkanaal. Dit mechanisme zorgt ervoor dat de verwachte doeltreffendheid van de tumor te verspreiden en voorkomt overconsumptie van voedingsstoffen in microkanaal. Na het voltooien van de migratie over de microkanaal, een cel herwint haar neiging tot multidirectionele uitsteeksels en verdere exploratie invasie doelen of nieuwe migratie paden. De compartimentering microfluïdische apparaat biedt een nieuwe in vitro betekent het creëren van een micro-omgeving voor het bestuderen van BTSC infiltratie van de hersenen parenchym.
Deze werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van kanker stamcellen (CSC) en trekkende cellijnen afgeleid van andere soorten tumoren. Kweken van cellen in de microfluïdische inrichting kan uitgevoerd worden in elke moderne biologie laboratorium dat is uitgerust met een incubator en weefselkweek expertise. Uitgerust met een su-8 meester, PDMSgieten en het apparaat assemblage haalbaar zijn met een aantal fundamentele opleiding in zachte lithografie. Daarnaast kan het platform worden uitgebreid voor andere toepassingen met integratie van andere functionele modules zoals gradiënt mixer, oppervlakte patronen, vloeibare controle en microelectrode.
The authors have nothing to disclose.
PAC wordt gedeeltelijk ondersteund door een NIH T32 subsidie bij Universiteit van Wisconsin Stem Cell Training Program (PA Clark). JSK werd gedeeltelijk ondersteund door de HEADRUSH Hersentumor Onderzoek hoogleraar, Roger Loff Memorial GBM Onderzoek Fonds, en de UW Foundation / Neurochirurgie hersentumor onderzoek en onderwijs Fonds. JCW en YH worden gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidie NIBIB 1R01EB009103-01.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), high glucose | Gibco / Invitrogen | 11965 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Ham’s F12 | Gibco / Invitrogen | 31765 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
B27 supplement minus vitamin A | Gibco / Invitrogen | 12587-010 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Antibiotic-Antimycotic (PSA) | Gibco / Invitrogen | 15240 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Gibco / Invitrogen | PHG0313 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) , human recombinant | Gibco / Invitrogen | PHG0021 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Heparin sodium salt, from porcine intestinal mucosa | Sigma | H1027-250KU | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Laminin (natural mouse) | Gibco / Invitrogen | 23017-015 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Accutase | Millipore | SCR005 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Stem cell medium |
|
||
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)/ Heparin |
|
||
Epidermal Growth Factor (EGF) |
|
||
Heparin |
|
||
su-8 photoresist | MicroChem | ||
Silicon handle wafer | WRS Materials | 3P01-5SSP-INV | |
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
laminin | BD Bioscience | 50 μg/ml in PBS buffer for the final concentration | |
Biostation IM | Nikon instruments |