그대로 고립 Langendorff에 transmembrane 잠재력 (VM)과 일시적인 세포 내 칼슘 (CAT)의 광학 매핑하는 동안이 종이 자세히 해부 절차를, 수단 설치, 그리고 실험 조건 마우스 마음을 perfused.
마우스 마음이 수종의 유전 공학을위한 저비용 기술의 존재로 인해 심혈관 연구 인기있는 모델입니다. 마우스 심장의 심장 혈관 생리 phenotyping 쉽게 transmembrane 잠재력에 대한 다양한 프로브 (V M), 칼슘 과도 (CAT), 및 기타 매개 변수를 고용하는 형광 이미징을 사용하여 수행할 수 있습니다. 여기 – 수축 결합은 행동 잠재력과 세포 내 칼슘 역학의 특징이므로, 심장 1-4에서 같은 위치에서 동시에 V m 고양이 모두를지도에 매우 중요하다. Langendorff에서 동시 광학 매핑은 마우스 마음은 심장 마비, arrhythmias, 대사 질환 및 기타 심장 질환을 기본 메커니즘을 명료하게하다 수있는 잠재력이있다 perfused. 정품 인증을 시각화는 전도 속도, 작업 잠재 기간, 그리고 사이트의 수많은에 다른 매개 변수는 세포 수준 조사에서 얻을 수없는뿐만 광학 매핑 1,5,6에 의해 해결되었다. 본 논문에서 우리는 사용하는 최첨단 CMOS 이미징 기술.을 높은 spatio – 시간적 해상도 마우스 마음에 V m와 고양이의 동시 광학 매핑에 대한 계측 설치 및 실험 조건을 제시 이 방법으로 얻은 일관된 광학 녹음 Langendorff perfused 마우스 마음의 동시 광학 매핑이 가능하고 신뢰할 수있는 모두이다 보여줍니다.
이 실험에서 우리는 여기 – 수축과 심실 uncoupler의 수축이 억제 후 특히 중요합니다 작은 실리콘 튜브를 추가하여 Langendorff 재관류 방법을 수정했습니다. 실리콘 튜브는 솔루션 정체, 재관류 솔루션의 산성화 및 좌심실의 국소 빈혈의 개발을 방지하는 데 사용됩니다. 마우스 마음이 저체온증에 매우 민감합니다, 따라서 심장에 걸쳐 온도 변화는 행동 잠재력의 기간이에서 인공 차이가 발생할 수 있습니다. 따라서 난방 시스템은 실험 8 전체 기간 동안 37 ° C의 일정한 온도를 유지하기 위해 재관류 챔버에서 구현되었습니다. Langendorff 모델은 마음의 innervation을 유지하지 않기 때문에, 하나는 생리 동정심과 parasympathetic 톤 9 조사하기 위해 perfusate에 신경 전달 물질을 추가하는 것을 고려해야합니다. 역행 재관류 외에, 마음의 superfusion의 추가는 산도와 온도 등 적절한 환경 변수를 유지하는 데 도움이됩니다. 이 방법에서는 Langendorff perfused 마음이 수평으로 배치되었다. 수직 Langendorff 재관류 설정은 10도 사용할 수 있지만 약간 다른 심장 역학 11 발생할 수 있습니다. CMOS 카메라뿐만 아니라, 다른 메이커도 사용할 수 있으며,지도 V m 동시에 CAT 12 적용할 수 있습니다.
높은 spatio – 시간적 해상도의 CMOS 카메라 응용 프로그램은 레코딩의 정확성을 보장하지만, 광학 매핑 신호는 단일 세포에서되지 않습니다. 오히려 각각의 형광 신호가 광학 배율에 따라 세포의 수백 또는 수천에서 비롯됩니다. 더 큰 심실 형광 광 산란에 의해 심방 신호를 왜곡 수 있으므로 광학적으로 기록된 신호의 해석주의가 필요합니다. 마우스 준비의 또 다른 제한은 심장 13 작은 크기로 인해 표면의 곡률에 의해 유도된 신호 왜곡과 소음이다. 전도 속도 측정은뿐만 아니라 마우스 심장의 곡률에서뿐만 아니라 전극 극성과 가상 전극에서 변경할 수 있습니다. 전도 속도, 활성화 이방성 및 repolarization지도의 정확도를 달성하기 위해, 마음의 표면에 카메라의 초점을 수정하는 것은 필수적입니다.
이 방법에서는 실시간 ECG 녹음은 심장 전기 생리학의 광 조사를 보완할 수 있습니다. 전압에 민감한 염료 (RH237)과 칼슘 표시기 (로드 – 오전 2시)이 있기 때문에 자신의 빠른 응답 프로토콜 유사한 여기, 독특한 발광 스펙트럼 3,7에 사용됩니다. V m 고양이 RH237 이외 및로드 – 오전 2시 3 측정하는 데 사용할 수있는 염료의 다른 조합이 가능합니다. 대형 스토 크의 시프트 (> 200nm)와 소설 전압에 민감한 염료, PGHI이 때문에 PGHI 및로드 – 오전 2시 14 층 사이의 방출 파장의 높은 분리의 더 나은 V의 m 고양이의 신호를 허용 발견되었습니다. 향후 개선 소설 형광 프로브, 새로운 영상 감지기의 개발, 향상된 이미지 처리 소프트웨어를 탐구에 초점을 수 있습니다. 높은 해상도와 3D 광학 매핑을위한 새로운 광학 이미징 modalities 또한 광학 매핑 5 중요한 미래의 방향입니다.
The authors have nothing to disclose.
NIH는 R01 HL085369을 부여합니다.
Chemical | Company | Catalog Number |
NaCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S271-1 |
CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C79-500 |
KCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S217-500 |
MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | M33-500 |
NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S369-500 |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S233-3 |
D-Glucose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | D16-1 |
Blebbistatin | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | 1760 |
RH237 | Invitrogen, Carlsbad, CA | S1109 |
Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | R1244 |
Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA | P3000MP |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma, St. Louis, MO | D2650 |
Material | Company | Catalog Number |
PowerLab 26T | AD Instruments, Sydney, Australia |