رسم الخرائط البصرية إمكانيات العمل والعابرون الكالسيوم في القلب ماوس

1. إعداد الحلول المتقدمة الأسهم إعداد الحلول اثنين من الأسهم في حل Tyrode (16X) مقدما في الماء منزوع الأيونات وتخزينها في 4 درجات مئوية : الأسهم الأول (119.872 ز / كلوريد الصوديوم L ، 3.056 غرام / لتر CaCl 2 (2H 2 O) ، 5.6 غرام / لتر بوكل ، 2.6274 غ / ل ناه 2 ص 4 و 3.408 غرام / لتر MgCl 2 (6H 2 O) ، (فيشر العلمي ، ديكورات المعرض ، ونيو جيرسي)) ؛ الأسهم الثاني (26.88 غرام / لتر NaHCO3 ، (فيشر العلمية ، ديكورات المعرض ، ونيو جيرسي)). إعداد حلول المخزون من الأصباغ الفلورية. لتجنب تكرار تجميد والذوبان ، نقوم بتخزين 30 aliquots ميكرولتر من الأصباغ في كل من -20 درجة مئوية ، وهو ما يكفي لتجربة واحدة : الجهد الحساسة محلول المخزون صبغ RH237 (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، 1.25 ملغ / مل حل في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO ، سيغما ، وسانت لويس ، MO) ؛ الكالسيوم مؤشر Rhod ، 02:00 محلول المخزون (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، 1 ملغ / مل حل في DMSO. إعداد الإثارة ، تقلص المخزون blebbistatin حل uncoupler (Tocris العلوم البيولوجية ، وسانت لويس ، MO ، 2 ملغ / مل حل في DMSO) مقدما وتخزين blebbistatin الذائبة في 4 درجات مئوية. 2. إعداد حلول الارواء والإعداد التجريبية 7 يعد حديثا في حل Tyrode 2L (128.2mM كلوريد الصوديوم ، CaCl 1.3mM 2 (2H 2 O) ، 4.7mM بوكل ، 1.05mM MgCl 2 (6H 2 O) ، 1.19mM ناه 2 ص 4 ، NaHCO 20mM 3 ، 11.1mM D – غلوكوز منزوع الأيونات في درجة الحموضة والمياه = 7.35 ± 0.05). إذا كان يتم استخدام محلول المخزون لجعل 2L حل لTyrode (تكفي لتجربة واحدة) تأخذ 1750 مل من الماء منزوع الأيونات وتخلط في 125 مل من ألبوم I ، 125 مل من ألبوم الثاني ، و4G من الجلوكوز. بدوره على اثنين من مضخات نظم الارواء. ضبط مضخة تمعجية (شبه ستار ، WPI ، ساراسوتا ، الولايات المتحدة) التي يتم استخدامها لنضح الوراء الى 40 مل / دقيقة. ضبط مضخة أخرى تمعجية (كول ، Parmer مضخة Peristalic Masterflex L / S ، كول ، Parmer شركة الصك ، فيرنون هيلز ، ايلينوي) التي يتم استخدامها لsuperfusion وللعودة مرة أخرى إلى سائل الإرواء الخزان القابضة على 80 مل / دقيقة. غسل نظام الارواء مع الإيثانول 70 ٪ لمدة 30 دقيقة ثم مع الماء منزوع الأيونات 2L. بمجرد أن يتم إجلاء جميع الماء منزوع الأيونات من الغرفة ، وتعميم الحل Tyrode وتمريرها من خلال مرشح 5 ميكرون (ميليبور ، فالجهاز يبث اشعة تماثل ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة). تسخين سائل الإرواء إلى +37 درجة مئوية مع سترة المياه وشكل دائري (ThermoNESLAB EX7 ، نيوتاون ، الولايات المتحدة) وسائل الإرواء الأوكسجين من قبل محتدما O 2 / CO 2 (95 ٪ / 5 ٪) الغاز الى الحل. رصد الرقم الهيدروجيني من الحل مع متر الرقم الهيدروجيني (أوكتون الآلات ، وفيرنون هيلز ، IL) ، وضبط معدل O 2 / CO 2 محتدما للحفاظ على درجة الحموضة في 7.35 ± 0.05. تواصل رصد درجة الحموضة ودرجة الحرارة أثناء التجربة. المزدوج جهاز رسم الخرائط البصرية يتكون من اثنين من كاميرات CMOS MiCAM أولتيما – L (SciMedia ، وكوستا ميسا ، كاليفورنيا) التي مكانية عالية (100×100 بكسل ، 230 ± 20 ميكرون لكل بكسل) والزمانية القرار (1،000-3،000 إطارات / ثانية). الإصلاح مرشح تمرير النطاق (590 ± 15 نانومتر ، Thorlabs ، نيوتن ، نيوجيرسي) أمام كاميرا التصوير الكالسيوم المعين ، في حين ، مرشح تمرير طويل (> 700 نانومتر ، Thorlabs ، نيوتن ، نيوجيرسي) يحتاج إلى وضعه في أمام الكاميرا الجهد التصوير المعينة. يتم ترتيب الكاميرات عمودي على بعضها البعض بواسطة حامل ، والذي يحتوي على مرآة مزدوج اللون (635 قطع نانومتر ، أوميغا البصرية ، براتلبورو ، VT). مباشرة أسفل حامل الكاميرا المزدوجة هناك العدسة (نيكون NIKKOR 55 ملم 1:1.4 235052) ، والذي يركز الضوء الانبعاثات تأتي من القلب على المرآة مزدوج اللون. المسافة العمل هو 3cm تقريبا. يتم إنشاؤها على ضوء الإثارة بواسطة مصباح الهالوجين (نيوبورت اوريل الآلات ، ستراتفورد ، CT ؛ SciMedia ، وكوستا ميسا ، كاليفورنيا) ، ويتم تمريرها من خلال مرشح الحرارة ، ومصراع الكاميرا ، والفرقة تمرير التصفية (520 ± 45 نانومتر). دليل ضوء مرونة يوجه ضوء الفرقة تمرير تصفيتها على إعداد ، ويستخدم مصراع للتأكد من أن تتعرض للضوء التحضير فقط خلال الحصول على الصور لتجنب photobleaching من الأصباغ. إعداد حج / 2 AgCl أقطاب للسرعة والاستشعار عن بعد في وقت مبكر وتثبيتها في الغرفة قبل وضعها في القلب. تأكد من أن يتم ضبط مكبرات الصوت والمرشحات إلى مستويات مناسبة. 3. حصاد قلب فأر ، يقني ؛ يدخل القنية ، وإعداد Langendorff نضح تخدير الفأر مع الكيتامين / زيلازين (ketamin ، 80mg/kg وزن الجسم ؛ زيلازين ، و 10 ملغم / كغم من وزن الجسم) والهيبارين (100 وحدة) عن طريق الحقن داخل الصفاق. أؤكد مستوى مناسب من التخدير بسبب عدم وجود منعكس الألم. بعد شق منتصف القصية ، بسرعة إزالة القلب وغسله في الاوكسيجين (95 ٪ O 2 ، 5 ٪ CO 2) ، ودرجة حرارة ثابتة (37 ± 1 درجة مئوية) محلول تايرود. باستخدام مجهر تشريح، وتحديد بسرعة الأبهر واجراء خفض نظيفة عبر الشريان الأبهر الصاعد أدناه الشريان تحت الترقوة اليمنى. ومن ثم تعلق مقطع قصير من الشريان الأورطي إلى العرف عيار 21 قنية مع طرف اندلعت. يستخدم 4-0 خياطة الحرير الأسود مضفر (تخصصات جراحية المؤسسة ، القراءة ، والسلطة الفلسطينية) لإصلاح القلب على القنية. بعد إقناء ؛ إدخال القنية ، وperfused retrogradely القلب وsuperfused مع الحل في Tyrode. يتم ضبط معدل نضح الوراء في مجموعة من 2-5 مليلتر / دقيقة للحفاظ على الضغط الأبهري ما بين 60 و 80 مم زئبق (محول الضغط والدقة الصكوك العالمية المؤتمر الوطني العراقي (WPI) ، ساراسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ جسر TBM4M مكبر للصوت ، WPI ، ساراسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد مقنى القلب ، ثم يتم تشريح الرئة ، والغدة الصعترية ، والأنسجة الدهنية وإزالتها. ويعلق قلب معزولة (أدوات العلوم الجميلة) في قمة لقاع الغرفة التروية (Sylgard مغلفة) لمنع تدفق بفعل الحركة. وامتدت أيضا لواحق اليمين واليسار الأذيني ودبس (أدوات العلوم الجميلة ، المؤتمر الوطني العراقي ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا) في الجزء السفلي من الغرفة ، والتي توفر أقصى قدر من المساحة السطحية للالقياسات البصرية من الأذينين. مهم جدا! يتم إدخال أنبوب السيليكون الصغيرة في البطين الأيسر عن طريق الأوردة الرئوية والثابتة التي لخياطة الحرير النسيج الضام في مكان قريب. هذا يمنع الازدحام الحل وتحمض سائل الإرواء المحاصرين في البطين الأيسر ، وهو أمر مهم خصوصا بعد قمع انقباضات البطين مع uncoupler الإثارة – انكماش (انظر الجزء 4 الخطوة 19). يوضع القطب الكهربائي العرف على سطح القلب لإجراء عمليات تحفيز سرعة ، والتي تم إنشاؤها بواسطة ماجستير – 8 (AMP صكوك المحدودة ، القدس ، إسرائيل) أو PowerLab 26T (AD الآلات ، سيدني ، أستراليا). تم إصلاح زجاج غطاء صغير على السطح من الحل على القلب لخفض قطعة أثرية الحركة من حل تهتز. تسليط الضوء على إثارة القلب. بالإضافة إلى ذلك ، ضبط المسافة بين جهاز كاميرا مزدوجة والقلب بحيث يمكن الحصول على أقصى قدر من القرار. إيقاف جميع الأضواء في الغرفة وتبدأ التسجيلات الكهربائية باستخدام PowerLab 26T. 4. تحميل الجهد والأصباغ الكالسيوم الحساسة والإثارة uncoupler – الانكماش الاحماء 0.6 مل من blebbistatin. مزيج من 0.5 مل blebbistatin مع سائل الإرواء في الخزان القابضة. تمييع ما تبقى من 0.1 مل من blebbistatin في 1 مل من محلول Tyrode وحقن ببطء (خلال فترة 20 دقيقة) من خلال منفذ المخدرات يقع بالقرب من قنية. كما نلاحظ blebbistatin يقلل تدريجيا من القطع الأثرية الحركة. تمييع 30 ميكرولتر من الجهد محلول الصبغة الحساسة الأسهم RH237 في حل 1 مل Tyrode وحقن ببطء على مدى 5-7 دقائق بمنفذ حقن نفس blebbistatin. المؤشر 30 ميكرولتر Rhod الكالسيوم ، هو 02:00 01:01 مختلطة مع F127 Pluronic (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، 20 ٪ في حل DMSO) ثم في محلول مخفف من 1 مل Tyrode وتطبق ببطء على مدى 5-10 دقيقة عن طريق ميناء حقن نفسه . الانتظار لمدة 5-10 دقائق لblebbistatin والأصباغ لتصل إلى غشاء الخلية والعصارة الخلوية. تواصل مع البروتوكول عندما يتم قمعها تماما الاقتراح. رصد مستمر التسجيلات ECG خلال الإجراء بأكمله لضمان وظيفة الكهربائية العادية للقلب. تبدأ التسجيلات إشارة الفلورسنت باستخدام البرمجيات المخصصة SciMedia (SciMedia ، وكوستا ميسا ، كاليفورنيا). 5. ممثل النتائج : الشكل 1. الإعداد التجريبي لنضح والتسجيلات الكهربائية ورسم الخرائط البصرية. EM = الانبعاثات ؛ ليرة لبنانية = longpass الشكل 2. إعداد التجارب والأمثلة إشارة سجلت خلال سرعة البطين. اليسار : يتم جمع إشارات تخطيط القلب من حج / AgCl أقطاب القرص 2 (الأعلى) ، ومثال على بروتوكول التحفيز S1S1 هو مبين (القاع). المركز : Langendorff إعداد قلب فأر. الحق : وتظهر امكانات الممثل عمل الاشارات الضوئية والكالسيوم عابرة من الأذينين (الأعلى) والبطينين (القاع). السهم الأصفر (الأعلى) يشير إلى تشتت الإشارات القادمة من الفلورسنت البطينين ، الذي ينظر إليه في التسجيلات الأذيني. LV = البطين الأيسر ؛ RV = البطين الأيمن ؛ LA = الأذين الأيسر ؛ RA = الأذين الأيمن الشكل 3. التسجيلات البصرية ممثل م الخامس والقط من البطينين في القلب من نوع الماوس البرية. A. إعداد تجريبية مع مجموعة من مواقع متباعدة بشكل متساو تميزت النقط السوداء التي التسجيلات البصرية يمكن أن ينظر في (C). باء مثال تتبع م الخامس واتفاقية مناهضة التعذيب من موقع مركزي على مجموعة (انظر المربع الأولن (C)). C. V م (الأزرق) ، واتفاقية مناهضة التعذيب (الحمراء) من مجموعة من مواقع متباعدة بشكل متساو. واهمال اشارات 3X3. الشكل 4. خريطة التنشيط والتوصيل. ألف التنشيط مثالا من قلب الخريطة نوع الماوس البرية مع المستعرض (T) والطولية (L) الاتجاهات المشار إليها السهام البيضاء. B. V إشارات م (الأعلى) و DV / دينارا (القاع) المقابلة لثلاث نقاط المشاهدة في A (T1 ، T2 ، T3 ، L1 ، L2 ، L3). الشكل 5. إمكانات العمل وتحليل الكالسيوم مدة عابر. A. مدة العمل المحتملة في عودة الاستقطاب ٪ 80 (APD80) ومدتها الكالسيوم عابرة في استرخاء ٪ 80 (CaD80) تظهر الخرائط من القلب تحت ظروف التحكم (يسار) وبعد 30 نانومتر تطبيق isoproterenol (يمين). اللون الأصفر / الأخضر في البطينين (الأيمن) يشير إلى تقصير isoproterenol APD80 وCaD80. باء مثال لاقتفاء أثر وAPD80 CaD80 من البطينين نوع الماوس البرية (الأعلى) ، والأذينين (القاع).