Ce document détaille la procédure de dissection, la configuration instrumentale, et des conditions expérimentales lors de la cartographie optique de potentiel transmembranaire (Vm) et de calcium intracellulaire transitoire (CAT) dans Langendorff isolés perfusés intacte cœur de la souris.
Le cœur de la souris est un modèle populaire pour les études cardiovasculaires en raison de l'existence d'une technologie à faible coût pour le génie génétique dans cette espèce. Phénotypage cardiovasculaire physiologique du cœur de souris peut être facilement fait en utilisant l'imagerie de fluorescence employant différentes sondes de potentiel transmembranaire (V m), les transitoires de calcium (CAT), et d'autres paramètres. Couplage excitation-contraction est caractérisée par une dynamique d'action du calcium intracellulaire potentiel et, par conséquent, il est extrêmement important de cartographier la fois V m et chat simultanément au même endroit sur le cœur 1-4. Simultanée de cartographie optique de Langendorff perfusé coeurs de souris a le potentiel pour élucider les mécanismes qui sous-tendent l'insuffisance cardiaque, les arythmies, les maladies métaboliques, et d'autres maladies cardiaques. Visualisation de l'activation, la vitesse de conduction, la durée du potentiel d'action, et d'autres paramètres à une myriade de sites ne peuvent pas être atteints de l'enquête au niveau cellulaire, mais est bien résolu par cartographie optique 1,5,6. Dans cet article nous présentons la configuration d'instrumentation et des conditions expérimentales pour la cartographie optique simultanée de V m et chat dans les cœurs de souris à haute résolution spatio-temporelle en utilisant l'état de l'art technologie d'imagerie CMOS. Conformément enregistrements optiques obtenus avec cette méthode montrent que la cartographie simultanée optique de coeurs perfusés de Langendorff la souris est à la fois réalisable et fiable.
Dans cette expérience, nous avons modifié la méthode de perfusion de Langendorff en ajoutant un tube de silicium faible, ce qui est particulièrement crucial après la suppression des contractions ventriculaires avec un découplant excitation-contraction. Le tube de silicium est utilisé pour prévenir la congestion solution, l'acidification de la solution de perfusion, et le développement de l'ischémie dans le ventricule gauche. Le cœur de la souris est très sensible à l'hypothermie; ainsi, les variations de température à travers le cœur d'entraîner des variations artificielles dans la durée du potentiel d'action. Par conséquent, un système de chauffage a été mis en œuvre dans la chambre de perfusion afin de maintenir une température constante de 37 ° C pendant la totalité de l'expérience 8. Depuis un modèle de Langendorff ne conserve pas l'innervation du cœur, on doit envisager d'ajouter neurotransmetteurs pour le perfusat afin d'enquêter physiologiques du tonus sympathique et parasympathique 9. Outre une perfusion rétrograde, plus de surfusion du cœur aide à maintenir adaptée paramètres environnementaux tels que le pH et la température. Dans cette méthode, le coeur perfusé de Langendorff a été placée horizontalement. Une configuration de Langendorff verticales perfusion peut également être utilisé 10, mais peut entraîner un peu différent mécanique cardiaque 11. En plus de caméras CMOS, des détecteurs de rechange sont également disponibles et peuvent être appliquées à la carte V m et chat simultanément 12.
Application de caméras CMOS de haute résolution spatio-temporelle assure la précision des enregistrements, mais les signaux optiques ne sont pas la cartographie d'une seule cellule. Au contraire, chaque signal de fluorescence provient de centaines ou de milliers de cellules, en fonction de grossissement optique. La fluorescence du ventricule beaucoup plus grand peut fausser les signaux auriculaire par diffusion optique, par conséquent, une interprétation prudente des signaux enregistrés optiquement est nécessaire. Une autre limitation de la préparation de la souris est la distorsion du signal et le bruit induit par la courbure de la surface en raison de la petite taille du cœur 13. Mesures de vitesse de conduction peut être modifié non seulement par la courbure de la souris, mais aussi le cœur de la polarité des électrodes et des électrodes virtuel. Pour atteindre la précision pour la vitesse de conduction, l'anisotropie d'activation, et des cartes de repolarisation, de rectification et de focalisation de la caméra à la surface du cœur est essentielle.
Dans cette méthode, en temps réel les enregistrements ECG peuvent compléter la recherche optique de l'électrophysiologie cardiaque. Tension colorant sensible (RH237) et l'indicateur de calcium (Rhod-deux heures) sont utilisés dans le protocole en raison de leur réponse rapide, d'excitation semblables, et les spectres d'émission distincts 3,7. Il ya d'autres combinaisons de colorants qui peuvent être utilisés pour mesurer V m et CAT autres que RH237 et Rhod-2 heures 3. Un roman sensible au voltage colorant, PGHI, avec un grand déplacement de Stoke (> 200nm) a été trouvée pour permettre une meilleure m V et les signaux de chat car la plus grande séparation des longueurs d'onde d'émission entre PGHI et Rhod-2 heures 14. Les améliorations futures peuvent se concentrer sur l'exploration de nouvelles sondes fluorescentes, le développement de détecteurs d'imagerie, et l'amélioration des logiciels de traitement d'image. Une résolution et une nouvelle imagerie optique pour la cartographie 3D optique sont aussi importants les orientations futures de la cartographie optique 5.
The authors have nothing to disclose.
NIH subventions R01 HL085369.
Chemical | Company | Catalog Number |
NaCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S271-1 |
CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C79-500 |
KCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S217-500 |
MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | M33-500 |
NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S369-500 |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S233-3 |
D-Glucose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | D16-1 |
Blebbistatin | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | 1760 |
RH237 | Invitrogen, Carlsbad, CA | S1109 |
Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | R1244 |
Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA | P3000MP |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma, St. Louis, MO | D2650 |
Material | Company | Catalog Number |
PowerLab 26T | AD Instruments, Sydney, Australia |