Cercarial Transformatie en In vitro Teelt van Schistosoma mansoni Schistosomules

Veiligheidsmaatregelen: Schistosome cercariae kan direct doordringen in de huid zonder de behoeften van een gesneden of poriën, en de oorzaak van de chronische ziekte schistosomiasis. S. mansoni is een bioveiligheidsniveau twee organisme, dus de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en de juiste veiligheidsmaatregelen moeten worden gevolgd bij het ​​werken met infectieuze cercaria. Het merendeel van de apparatuur die nodig is om te groeien en te transformeren schistosomen is standaard, met een paar belangrijke uitzonderingen vermeld in de tabel aan het einde van het protocol. Alle cercarial werk moet worden gedaan in een geïsoleerde kamer. Schistosomules moet worden gekweekt in een steriele, goedgekeurd bioveiligheid kap. Twee lagen nitril of latex handschoenen worden gedragen, evenals een laboratoriumjas, een waterdichte paar schoenen, broek met geen gaten of scheuren, en waterdicht mouwbeschermers voor uw polsen en armen. In het geval van een ongeluk morsen, onmiddellijk spuiten verontreinigde plek met 70% ethanol of 10% bleekmiddel, wrijven krachtig als op uw persoon. Dit zal voldoende zijn om de parasiet uit te schakelen, maar alle mogelijke infecties moeten worden gemeld en serieus genomen. Hoewel schistosomules zijn niet aangeboren besmettelijk, institutionele richtlijnen variëren, en dient te worden geraadpleegd om te bepalen of BSL2 voorzorgsmaatregelen nodig zijn tijdens de niet-infectieuze levensfasen. Desinfecteer alle oppervlakken die in contact komen met potentieel besmettelijke stof na het experiment wordt uitgevoerd en gooi afval in een goedgekeurd biohazard container. LET OP: Cover slak gastheer bakken 1 tot 2 dagen voorafgaand aan de uitscheiding en bescherming tegen licht 1. Oogsten cercariae van de slak gastheer Vul een schone, 500ml beker vrij van detergenten de helft vol met gedestilleerd water op kamertemperatuur. Als het werken met host slakken geïnfecteerd met miracidia op verschillende data, gebruik dan een aparte beker voor elke infectie datum (Dit is vooral van belang als de slakken zal worden hergebruikt voor toekomstige experimenten). De grootte van de beker kan ook kleiner zijn, afhankelijk van de ervaring van de gebruiker. Verzamel geïnfecteerde slak hosts die u wilt werpen en zorgvuldig deponeren ze in de beker met behulp van een standaard aquarium vissen net en voor algemene doeleinden tang als nodig is. Plaats bekerglas op een spill ongeveer 8 tot 12 centimeter lade onder een gloeilamp. Laat staan ​​voor 1-2 uur onder het licht. Cercariae verlaten de slak gastheer wanneer ze worden blootgesteld aan fel licht. Zorgvuldig te filteren slakken uit de cercariae mengsel. Neem extra voorzorgsmaatregelen, als mengsel is zeer besmettelijk. Onthoud cercariae direct kan de menselijke huid binnen te dringen! Vervang mengsel onder lichtbron gedurende ongeveer 15 minuten, waardoor alle deeltjes afvalstoffen om zich te vestigen. Transfer cercariae in een schone erlenmeyer met behulp van een pipet, het vermijden van het puin op de bodem van de beker. Plaats de kolf op ongeveer een hoek van 45 ° op het ijs in het donker voor 45 – 60 minuten, waardoor cercariae zich te vestigen in een hoek. Gebruik een 50 ml pipet tot 75 tot 90% van het supernatant te verwijderen en deze deponeren in bekerglas met 10% bleekmiddel of 70% ethanol, waarbij zorg niet te laten waterdruppels bevat cercariae druppelen uit de pipet. Schud de erlenmeyer met cercariae zachtjes aan de cercariae in oplossing mengen. Gebruik een pipet om het monster over te dragen aan steriele 50 ml conische buizen. Weer plaats buizen op ijs gedurende 20 minuten in het donker. Cercariae zal regelen naar de onderkant van de buis in het donker. 2. Handmatige transformatie van cercariae aan schistosomules Voordat u begint: Zorg RPMI 1640 compleet (RPMI, 5% Fetal Bovine Serum, 1X Pen / Strep) en warm tot 37 ° C. (Het is cruciaal dat de foetale gebruikte bovine serum werd geïnactiveerd door incubatie een 56 ° C gedurende 1 uur als schistosomen kunnen gevoelig zijn aan te vullen). In een biohazard kap, verwijder supernatant tot 5 tot 10 ml van de oplossing in elk 50 ml conische met behulp van een pipet of vacuüm apparaat. Bevestig een 22 gauge double-ended, Luer Lok emulgeren naald om een ​​juiste maat spuit. Langzaam trekken mengsel in de spuit. Verzamel cercariae van alle 50 ml buizen in een spuit. Wees attent van druipen. Draai spuit over zulke dat de losse naald einde is omhoog. Bevestig de andere spuit om deze kant van het emulgeren naald. Passeren het mengsel door de naald in totaal 40 keer (20 keer heen en weer) naar de cercariae transformeren. Plaats de spuiten verticaal zodanig dat het mengsel is opgenomen in de bodem spuit en de bovenkant spuit leeg is. Verwijder de top spuit en desinfecteren in 70% ethanol. Borgsom mengsel druppelsgewijs in een schone hoog ommuurde 100mm x 50mm pyrex schotel of kristalliserende schotel. Desinfecteer naald en spuit in 70% ethanol. Voeg 37 ° C RPMI 1640 complete media zodanig dat debodem van de petrischaal is volledig bedekt, als het gieten een Luria bouillon plaat. Roer voorzichtig om schistosomules verzamelen in het midden van de petrischaal. Vermijd spatten. Opmerking: Het kan nuttig zijn uit te schakelen de motorkap licht voor deze stap om meer adequaat te visualiseren de schistosomules in het centrum. Onmiddellijk storten geconcentreerd schistosomules in een frisse 12-well celkweek plaat goed af met een steriele pipet. Herhalen 2.9 en 2.10 tot schistosomules niet meer aanwezig zijn in het centrum van de schotel (ongeveer 10 keer). Storting elk vervolgens wordt opgevangen in een frisse goed. Vul elk putje tot halverwege (~ 1,5 ml) met een voorverwarmde RPMI complete media. Visualiseren op een omgekeerde microscoop op de aanwezigheid van schistosomules en afwezigheid van cercariae te verifiëren. Groeien de schistosomules in een CO 2 incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO 2. 3. Representatieve resultaten: In afwachting van de overdracht van getransformeerde schistosomules in cultuur media, visualisatie onder een omgekeerde bright-veld microscoop (zie tabel apparatuur voor een voorbeeld) moet opleveren een afbeelding lijkt op een, waarin alleen getransformeerd schistosomules aanwezig zijn in de goed figuur. Potentiële contaminanten kunnen zijn intact cercariae, doorgesneden cercarial staarten, of ander afval. Als er geen omgekeerde microscoop beschikbaar is, wordt een standaard microscoop of zelfs een dissectie ruimte zijn voldoende om de schistosomules visualiseren. Merk op dat deze procedure niet altijd 100% van de cercariae transformeren. Figuur 1: Transformed Schistosomulum Figuur 2: cercariae en Severed Tails