Preparación Todo el montaje del Adulto Drosophila Cordón nervioso ventral para inyección gigante tinte de fibra
Summary
Un<em> In vivo</em> La disección de los adultos<em> Drosophila</emCable> nervioso ventral (VNC) se demuestra. Este método de disección en particular causa pocos daños en el VNC que permite el posterior marcado de las neuronas de fibra gigante con tinte fluorescente para obtener imágenes de alta resolución.
Abstract
Para analizar la morfología axonal y dendrítico de las neuronas, es esencial para obtener un correcto etiquetado de las estructuras neuronales. La preparación de muestras y etiquetado con poco o ningún daño a los tejidos nos permite analizar la morfología celular y para comparar las muestras individuales entre sí, permitiendo así la identificación de anomalías mutante.
En el método de disección demostró que el sistema nervioso sigue siendo en su mayoría dentro de la mosca adulta. A través de una incisión dorsal, el abdomen y el tórax se abren y la mayor parte de los órganos internos son removidos. Sólo la parte dorsal del cordón nervioso ventral (VNC) y el conectivo cervical (CVC), que contiene los axones de las fibras grandes gigantes (FC) 1 se exponen, mientras que el cerebro contiene el cuerpo celular y las dendritas GF sigue siendo dos en la cabeza intacta . En esta preparación la mayoría de los nervios de la VNC debe permanecer unido a sus músculos.
Después de la disección, el relleno intracelular de la fibra gigante (GF), con un tinte fluorescente se demuestra. En la CVC de los axones GF se encuentran en la superficie dorsal y por lo tanto pueden ser fácilmente visualizados con un microscopio con contraste de interferencia diferencial (DIC) óptica. Esto permite la inyección de los axones GF con el tinte en este sitio para la etiqueta del GF completo, incluyendo los axones y sus terminales en el VNC. Este método da lugar a manchas confiable y fuerte de la FC que permite a las neuronas para formar una imagen inmediatamente después del llenado con un microscopio de epifluorescencia. Por otra parte, la señal fluorescente se puede mejorar utilizando los métodos convencionales de inmunohistoquímica 3 adecuada para la microscopía confocal de alta resolución.
Protocol
Discussion
El sistema nervioso se puede diseccionar sin extraerlo del cuerpo volar. Esto tiene dos ventajas, en primer lugar, la disección causa poco daño al sistema nervioso, y en segundo lugar, la mayoría de los nervios permanecer conectados a los músculos y órganos sensoriales. Realización de la disección, como se describe, se prepara la muestra para el directo de tinte etiquetado de las finanzas públicas. Convenientemente, las motoneuronas postsináptica a la FC permanecer conectados a los músculos. Axones, por lo tan…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El proyecto descrito fue apoyada por número de concesión R01HD050725 del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano para etiquetar el contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano o el Institutos Nacionales de Salud. Agradecemos a los miembros del laboratorio, así como Godenschwege Schreader Barbara por su aporte al manuscrito y video.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Ø 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
Riferimenti
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