Özgül İnsan ve Hayvan Virüsler Mikrobiyal Kaynak Takip için maliyet-etkin Yöntemi
Summary
Bu çalışma, MST araçları olarak önerilen insan / / sığır domuz DNA virüsleri, adenovirüs ve polyomaviruses, belirli bir miktar tayini için qPCR kullanarak suda nitrat dışkı / idrar kirlenme veya kontaminasyon kaynağının belirlenmesi için maliyet-etkin bir yöntem açıklanır.
Abstract
Ortamında mikrobiyal kirlenme önemli bir sağlık riski temsil eder. Klasik bakteri dışkı göstergeler önemli sınırlamalar olduğu gösterilmiştir, virüs bulaşma kaynağı bilgi birçok inaktivasyon işlemleri ve standart fekal göstergeler daha dayanıklıdır. Virüslerin su ve moleküler testlerin konsantrasyon için maliyet-etkin yöntemlerin geliştirilmesi, fekal kontaminasyon göstergeleri ve mikrobiyal kaynağı olarak izleme (MST) araçları gibi virüslerin uygulanabilirliği kolaylaştırır. Adenovirüsler ve polyomaviruses DNA virüsleri insanlarda dahil olmak üzere belirli omurgalı türlerin bulaşmasını ve ısrarla dışkı ve / veya incelenen tüm coğrafi bölgelerde idrar ile atılır. Daha önceki çalışmalarda, biz insan adenovirüs (HAdV) ve insan fekal kontaminasyonun bir göstergesi olarak kantitatif PCR (qPCR) JC polyomaviruses (JCPyV) miktarının önerdi. Son zamanlarda, biz por özel ölçümü için qPCR testleri geliştirdikcine adenovirüs (PAdV) ve büyükbaş hayvan fekal kontaminasyon belirteç olarak test tüpü başına 1-10 genom kopya hassasiyetleri polyomaviruses (BPyV). Bu çalışmada, biz bu araçları kullanarak su örneklerinde kirlilik kaynağını belirlemek için izlenecek prosedür mevcut. Temsili sonuçlar örnek olarak, yüksek düzeyde nitrat sunan yeraltı suyu virüs analizi gösterilmektedir.
Düşük veya orta derecede kirli sularda virüslerin tespiti çok daha küçük bir hacim, genellikle iki seri konsantrasyon adımları içeren bir prosedür en azından birkaç litre su virüslerin konsantrasyonu gerektirir. Bu biraz hantal bir prosedür ve viral kurtarma gözlenen değişkenlik su örneklerinin çok sayıda eşzamanlı işlem önemli ölçüde engel teşkil etmektedir.
Önceki Studie geliştirilen bir adım protokolü uygulanan iki adım yordamlar kaynaklanan darboğaz ortadan kaldırmak içins ve su matrisler bir çeşitlilik için de geçerlidir. Asitlenme on litre su örneklerinin, yağsız süt ile flokülasyon, topaklanmalara malzemelerin ağırlık sedimantasyon, çökelti ve santrifüj toplama, 10 ml fosfat tamponu çökelti, tabanda: Bu prosedür içerir. Viral konsantre viral nükleik asitler ve özel adenovirüs ve ilgi polyomaviruses qPCR tarafından sayısal çıkarılması için kullanılır. Çok sayıda numune eş zamanlı olarak bu düşük maliyetli konsantrasyon yöntemi kullanılarak analiz edilebilir.
Bu prosedür, suları, deniz suyu ve nehir suyu analiz uygulanmış ve bu çalışmada, yeraltı suyu numuneleri analiz sonuçları sunmak olmuştur. Bu yüksek verim nicel yöntem, basit, güvenilir ve maliyet-etkin.
Protocol
Discussion
Tekrarlanabilir, güvenilir, basit ve maliyet-etkin açıklanan prosedürü rutin çevre ve halk sağlığı laboratuvarları için uygun bir yöntem için gerekli koşulları yerine getirecektir. Protokol basittir; ancak dikkatli bir şekilde takip edilmelidir. Flokülasyon için karıştırma süresi önemli ölçüde azalır (örneğin en az 5 saat) durumunda olacağı gibi, yapay deniz suyu tuzlarının istenen konsantrasyon eklemeden örneklerinde düşük iletkenlik virüs kurtarma önemli ölçüde azaltaca…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, kısmen Avrupa Birliği Araştırma Çerçeve 7 finanse edilen projeler VIROBATHE (Sözleşme No: 513.648), VIROCLIME (Sözleşme No. 243.923 tarafından, İspanyol Hükümeti "Ministerio de educacion y Ciencia" (proje AGL2008-05275-C01/ALI) tarafından desteklenmiştir. ) ve Su Katalan Ajansı, Agencia Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de Kontrolü i Millora dels Ecosistemes Aquatics. Gelişmiş çalışma sırasında Marta Rusiñol Katalan Hükümeti "AGAUR" (FI-DGR) bir adam oldu.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
Riferimenti
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
