Método rentable para el Rastreo de uso microbiana específica virus humanos y animales
Summary
El estudio describe un método costo-efectivo para la identificación de la fuente de contaminación fecal / orina o la contaminación por nitratos en el agua utilizando qPCR para la cuantificación específica de los virus de ADN humano / porcino / bovino, adenovirus y poliomavirus, propuesto como herramientas de MST.
Abstract
La contaminación microbiana del medio ambiente representa un riesgo significativo para la salud. Clásicos indicadores fecales bacterianos han demostrado que tienen limitaciones significativas, los virus son más resistentes a procesos de inactivación y muchos indicadores estándar fecal no informan sobre la fuente de contaminación. El desarrollo de métodos eficientes para la concentración de virus a partir de agua y ensayos moleculares facilita la aplicación de los virus como indicadores de contaminación fecal y herramientas de software como el seguimiento microbiano (MST). Adenovirus y poliomavirus son virus ADN infectar a especies específicas de vertebrados incluyendo a los humanos y son persistentemente excreta en las heces y / o de orina en todas las áreas geográficas estudiadas. En estudios anteriores, hemos sugerido la cuantificación de los adenovirus humanos (HAdV) y poliomavirus JC (JCPyV) por PCR cuantitativa (qPCR) como un índice de contaminación fecal humana. Recientemente, se han desarrollado ensayos de PCR cuantitativa para la cuantificación específica del porcine adenovirus (PADV) y poliomavirus bovina (BPYV) como animales marcadores de contaminación fecal con la sensibilidad de copias del genoma 1.10 por tubo de ensayo. En este estudio, se presenta el procedimiento a seguir para identificar la fuente de contaminación en muestras de agua usando estas herramientas. Como ejemplo de resultados representativos, el análisis de virus en el agua subterránea presenta altos niveles de nitratos se muestra.
Detección de virus en las aguas contaminadas de baja o moderada requiere la concentración de los virus por lo menos de varios litros de agua en un volumen mucho menor, un procedimiento que generalmente consta de dos etapas de concentración en serie. Este procedimiento un tanto engorroso y la variabilidad observada en la recuperación viral significativamente interferir con el procesamiento simultáneo de un gran número de muestras de agua.
Con el fin de eliminar los cuellos de botella causados por los procedimientos de dos pasos que hemos aplicado un protocolo de un solo paso desarrollado en Studie anteriors, y aplicable a una diversidad de matrices de agua. El procedimiento incluye: la acidificación de las muestras de agua de diez litros, floculación de la leche desnatada en polvo, sedimentación por gravedad de los materiales floculada, la recogida del precipitado y centrifugación, resuspensión del precipitado en tampón fosfato 10 ml. El concentrado viral se utiliza para la extracción de ácidos nucleicos virales y los adenovirus y poliomavirus específicos de interés se han cuantificado mediante qPCR. Alto número de muestras se podrá analizar simultáneamente con este método de concentración de bajo costo.
El procedimiento se ha aplicado al análisis de las aguas de baño, agua de mar y agua de los ríos y en este estudio, se presentan los resultados de analizar muestras de agua subterránea. Este método cuantitativo de alto rendimiento es fiable, sencilla y rentable.
Protocol
Discussion
El procedimiento descrito se cumplen las condiciones para un método de ajuste de rutina de los laboratorios de salud ambiental y pública: reproducible, fiable, sencillo y rentable. El protocolo es sencillo, sin embargo, deben seguirse estrictamente. Baja conductividad en las muestras sin necesidad de añadir la concentración de sales pidió agua de mar artificial reduciría dramáticamente la recuperación de los virus, como sería el caso si el tiempo de agitación para la floculación es significativamente re…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue parcialmente financiado por el Gobierno español "Ministerio de Educación y Ciencia" (proyecto AGL2008-05275-C01/ALI), por el Marco Europeo de Investigación de la Unión siete proyectos financiados VIROBATHE (Contrato N º 513.648), VIROCLIME (Contrato N º 243923 ) y por la Agencia Catalán de agua, Agència Catalana de l'Aigua (ACA), Departamento de Control i Millora dels Ecosistemes acuáticos. Durante el estudio desarrollado Marta Rusiñol era un compañero del catalán Gobierno "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
Riferimenti
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
